發(fā)布時(shí)間：2020-10-16 00:17

　　 精原干細(xì)胞(SSCs)是一種特殊的、也是唯一能夠?qū)⑿坌圆溉閯?dòng)物的遺傳物質(zhì)遺傳給子代的二倍體細(xì)胞。目前,SSCs已被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)、男性不育癥的治療等領(lǐng)域。然而,SSCs的體外培養(yǎng)技術(shù)尚不完善,與SSCs增殖有關(guān)的通路和機(jī)制尚不明確。為了研究表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)對(duì)山羊SSCs體外增殖的影響,本研究將60-75日齡的山羊睪丸(n=6)剪碎后,利用兩步酶消化法得到睪丸單細(xì)胞懸液,然后通過(guò)兩次差速貼壁法分離純化山羊SSCs,采用堿性磷酸酶染色法及免疫熒光染色法鑒定山羊SSCs。隨后,單獨(dú)添加不同濃度的EGF和PDGF-BB,并聯(lián)合添加EGF和PDGF-BB培養(yǎng)山羊SSCs。利用甲基噻唑基四唑(MTT)法分別檢測(cè)SSCs培養(yǎng)3天,6天和9天后的吸光度,篩選最佳單獨(dú)添加濃度和配伍添加濃度;然后,利用western blotting檢測(cè)空白對(duì)照組及3個(gè)最佳濃度試驗(yàn)組中的ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)量,運(yùn)用real time PCR技術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組及3個(gè)最佳濃度試驗(yàn)組中BAD、BCL2和BAX基因的相對(duì)表達(dá)量;最后,添加MEK1/2的特異性抑制劑PD0325901后,再次檢測(cè)空白對(duì)照組及3個(gè)最佳濃度試驗(yàn)組中的ERK1/2蛋白、磷酸化ERK1/2蛋白、BAD、BCL2和BAX基因的表達(dá)量。主要研究結(jié)果如下:1.睪丸單細(xì)胞懸液經(jīng)兩次差速貼壁純化后,能夠獲得純度較高的SSCs。染色結(jié)果顯示,純化后的細(xì)胞經(jīng)鈣鈷法堿性磷酸酶染色后呈AKP陽(yáng)性,SSCs被染色成黑色;免疫熒光染色結(jié)果表明,純化后的細(xì)胞大量表達(dá)SSCs的標(biāo)記分子THY1和PLZF。2.與對(duì)照組相比,單獨(dú)添加25 ng/mL EGF或35 ng/mL EGF均可以顯著促進(jìn)山羊SSCs的自我更新(P0.05),但兩者之間差異不顯著(P0.05);單獨(dú)添加20 ng/mL的PDGF-BB的效果最佳(P0.05);同時(shí)添加25 ng/mL的EGF和20 ng/mL的PDGF-BB對(duì)山羊SSCs的增殖效果顯著高于其他組合(P0.05),培養(yǎng)6 d后,其OD_(490)為0.736。3.Western blotting結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,3個(gè)最佳試驗(yàn)組的ERK1/2蛋白的表達(dá)均有不同程度的升高,其中聯(lián)合添加20 ng/mL PDGF-BB+25 ng/mL EGF處理組的增幅最大,單獨(dú)添加20 ng/mL的PDGF-BB處理組變化最小;添加MEK1/2的特異性抑制劑后,4個(gè)處理組的ERK1/2蛋白的表達(dá)水平均降低,但3個(gè)試驗(yàn)組的變化幅度小于對(duì)照組。對(duì)照組的磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)量均明顯低于其他3個(gè)試驗(yàn)組,后者大約是前者的3~5倍;添加特異性抑制劑后,4個(gè)處理組的磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)量降低至原先的10%~30%。4.real time PCR結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,3個(gè)試驗(yàn)組的BCL2基因表達(dá)量均上調(diào)。其中,聯(lián)合添加20 ng/mL PDGF-BB+25 ng/mL EGF處理組的細(xì)胞抗凋亡能力顯著高于其他組(P0.05),25 ng/mL EGF組的BCL2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05),然而20 ng/mL PDGF-BB組中的抗凋亡基因BCL2表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異不顯著(P0.05);與其他所有試驗(yàn)組相比,對(duì)照組的促凋亡基因BAX和BAD的表達(dá)水平顯著升高(P0.05),而試驗(yàn)組之間差異均不顯著(P0.05)。添加PD0325901后,所有處理組中的抗凋亡基因BCL2的表達(dá)量極顯著降低(P0.001),僅為原先的10%~20%,而B(niǎo)AX和BAD表達(dá)水平極顯著升高(P0.001)。結(jié)論:單獨(dú)或聯(lián)合添加EGF和PDGF均有利于促進(jìn)山羊SSCs的自我更新,我們推測(cè)這兩種生長(zhǎng)因子可能是通過(guò)Ras/ERK1/2信號(hào)通路來(lái)調(diào)控山羊SSCs磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá),進(jìn)而提高SSCs的抗凋亡能力。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S827
【部分圖文】：

圖 1-1 SSCs 自我更新和分化示意圖（Komeya and Ogawa 2015）注：實(shí)心箭頭虛心剪頭表示 SSCs 分化，虛心剪頭表示 SSCs 自我更新。Fig.1-1 Schematic view of self renewal and differentiation of SSCs (Komeya and Ogawa 2015).Note: Solid and broken arrows indicate differentiation and self renewal, respectively.哺乳動(dòng)物精子發(fā)生起始于性原細(xì)胞（gonocytes）向SSCs的轉(zhuǎn)化，然而由于物種特異性的不同，精子發(fā)生的起始時(shí)間因物種的不同而有所差異。嚙齒類(lèi)動(dòng)物的精子發(fā)生一般起始于出生后5~7 d（5~7 day post partum，5~7 dpp），家畜通常需要數(shù)月才能完成由性原細(xì)胞向SSCs的轉(zhuǎn)化，如豬的精子發(fā)生常起始于出生后2~3個(gè)月（Zheng et al. 2014b），而人類(lèi)則需要在出生后10~13年才開(kāi)始進(jìn)行精子發(fā)生（Dym et al. 2009）。1.2 精原干細(xì)胞的分離與富集1.2.1 精原干細(xì)胞的分離一般來(lái)說(shuō)，睪丸中的 SSCs 的數(shù)量極少，有研究發(fā)現(xiàn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物睪丸中的 SSCs 大約占其總的生殖細(xì)胞數(shù)的 0.02%~0.03%，約占總精原細(xì)胞數(shù)的 1.25%，大約只有 10.6%的未分化的精原細(xì)胞屬于 SSCs，小鼠的每個(gè)睪丸中大約有 35000 個(gè) SSCs（Meistrich and

步驟見(jiàn)附件Ⅲ。 結(jié)果與分析.1 睪丸單細(xì)胞懸液利用機(jī)械分離結(jié)合兩步酶消化法可以獲得山羊睪丸單細(xì)胞懸液。此時(shí)，懸液中類(lèi)繁多，細(xì)胞形態(tài)、大小不均一，SSCs 純度較低（見(jiàn)圖 2-1A）。.2 山羊精原干細(xì)胞的純化經(jīng)差速貼壁純化后，從睪丸單細(xì)胞懸液中獲得純度較高的 SSCs，純化后的細(xì)胞卵圓形，其細(xì)胞大小基本均勻一致（見(jiàn)圖 2-1 B）。

大小基本均勻一致（見(jiàn)圖 2-1 B）。法純化山羊精原干細(xì)胞。（A）差速貼壁前，即睪丸單壁后。Scale bar=400 μm。n of goat SSCs using differential plating. (A) before diffee single cell suspension; (B) after differential plating. Scal胞的鑒定堿性磷酸酶（AKP）染色表明，體外培養(yǎng) 10 d 后，SSCs 出現(xiàn)小的細(xì)胞克狀沉淀（圖 2-2）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2842454