microRNAs是一類短的,高度保守的非編碼RNA,可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。MiR-3031作為一個功能性miRNA,參與調(diào)節(jié)奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳等多種重要的生物學(xué)過程。本試驗旨在研究POU2F3和miR-3031在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的靶向關(guān)系及其功能,為奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳提供理論依據(jù)。通過RT-qPCR,Western blot和構(gòu)建雙熒光素酶報告載體驗證miR-3031與POU2F3的靶向調(diào)節(jié)作用。生物信息學(xué)分析表明,POU2F3的3'UTR區(qū)包含miR-3031的結(jié)合位點。同時,miR-3031降低了PsiCHECKTM2-POU2F3 3'UTR-wt的雙熒光素酶活性。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,與對照組NC相比,miR-3031 mimics顯著降低POU2F3的mRNA和蛋白水平的表達(dá);結(jié)果表明POU2F3是miR-3031的靶基因。轉(zhuǎn)染miR-3031 24h、48h后CCK8檢測miR-3031對奶山羊乳腺上皮細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示,miR-3031 mimic顯著提高奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的活力。轉(zhuǎn)染siPOU2F3 24h后EDU檢測奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖的情況,結(jié)果顯示,干擾POU2F3顯著促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖。將siPOU2F3和si-NC轉(zhuǎn)染到乳腺上皮細(xì)胞中,進(jìn)一步研究POU2F3對奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡的作用機理。流式結(jié)果表明,siPOU2F3顯著抑制奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡。同時,siPOU2F3顯著抑制Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá),上調(diào)Bcl-2/Bax的比率;同時,檢測AKT和mTOR的磷酸化水平。結(jié)果表明,siPOU2F3顯著上調(diào)了AKT、mTOR的磷酸化水平和PTEN的蛋白水平以及顯著下調(diào)PI3K蛋白的表達(dá)。綜上所述,miR-3031靶向POU2F3通過AKT/mTOR信號通路促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖,抑制凋亡。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S827
【文章目錄】：
ABSTRACT
摘要
Chapter 1 INTRODUCTION
    1.1 Literature Review
    1.2 Research progress on mammary gland development in dairy goats
        1.2.1 Mammary gland development and lactation mechanism
        1.2.2 Breast epithelial cells research progress
    1.3 miRNA and mammary gland development
        1.3.1 Mechanism action of miRNAs
        1.3.2 Identification methods of miRNA target genes
        1.3.3 Regulation of miRNAs on mammary gland development
        1.3.4 Regulation of miRNA on lactation function
    1.4 Research progress of RNA interference technology
    1.5 Research progress of POU2F3 gene
    1.6 Research Content
    1.7 Research Plan
Chapter Ⅱ:Study on the Regulation of POU2F3 Gene by miR-3031
    1.8 Introduction
    1.9 Materials and methods
        1.9.1 Sample Collection
        1.9.2 Main equipment
        1.9.3 Main test reagents
        1.9.4 Prediction of miR-3031 target POU2F3 gene
        1.9.5 Construction of dual luciferase reporter vectors and mutant vectors
        1.9.6 Chemical synthesis of miRNA mimics
        1.9.7 293T cell co-transfection and luciferase activity assay
        1.9.8 Dairy goat mammary epithelial cell transfection
        1.9.9 Real time-qPCR
        1.9.10 Western blotting
        1.9.11 Western blot detection
        1.9.12 Statistical analysis of data
    1.10 Analysis of results
        1.10.1 Bio information prediction of miR-3031 target gene
        1.10.2 Cloning of the POU2F3-3'UTR region
        1.10.3 Construction of dual luciferase reporter vector
        1.10.4 Detection and analysis of luciferase activity
        1.10.5 Effect of miR-3031 on the m RNA level of POU2F3 gene
        1.10.6 Effect of miR-3031 on POU2F3 gene at protein level
        1.10.7 CCK8 method for detecting cell proliferation
        1.10.8 Discussion
    Summary
Chapter Ⅲ:Study on the Regulation of POU2F3 on Mammary Epithelial Cells in Dairy Goats..
    1.11 Introduction
    1.12 Materials and methods
        1.12.1 Collection of samples
        1.12.2 Main equipment
        1.12.3 Main test reagents
        1.12.4 Flow cytometry to detect apoptosis
        1.12.5 Edu incorporation assay
        1.12.6 Statistical Analysis
    1.13 Analysis of results
        1.13.1 POU2F3 Interference Efficiency Detection
        1.13.2 Apoptotic effect of miR-3031 on mammary epithelial cells
        1.13.3 Effect of POU2F3 interference on apoptosis genes in mammary epithelial cells
        1.13.4 Edu incorporation assay
        1.13.5 Effect of POU2F3 interference on P-m TOR/mTOR signaling pathway
        1.13.6 Effect of POU2F3 interference on PTEN synthesis in mammary epithelial cells
    1.14 Discussion
        1.14.1 Effect of POU2f3 on proliferation and apoptosis of mammary epithelial cells in dairy goats
        1.14.2 Regulation of POU2F3 on the lactation component of mammary gland epithelial cells in dairy goats
    Summary
CONCLUSION
INNOVATION
REFERENCE
ARTICLE
ACKNOWLEDGEMENT
APPENDIX
ABBREVIATION
PERSONAL STATEMENT

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本文編號：2838382