瘋草(Locoweed)是含有苦馬豆素(swainsonine,SW)的豆科棘豆屬和黃苗屬有毒植物的統(tǒng)稱,動物過量采食后表現(xiàn)出共濟失調(diào)、跛行、癱瘓等臨床癥狀。瘋草內(nèi)存在波狀芽管蠕孢菌(Undifilumspp),該真菌與瘋草中的毒性成分SW密切相關(guān)。研究該內(nèi)生真菌中SW合成的路徑,可以為調(diào)控瘋草脫毒奠定基礎(chǔ),并提供理論依據(jù)。目前,瘋草內(nèi)生真菌合成SW的具體途徑仍不確定,SW的提取率也較低,通過誘變手段可以有效調(diào)控SW的產(chǎn)率,為SW的進一步研究奠定基礎(chǔ)。本試驗主要對變異黃芪種子中的產(chǎn)SW內(nèi)生真菌進行分離與鑒定,使用該內(nèi)生真菌制備原生質(zhì)體,并進行轉(zhuǎn)化及再生,對該內(nèi)生真菌進行誘導(dǎo)選育,為進一步闡明SW的合成機理及突變菌株的選育提供理論基礎(chǔ)。1、從變異黃芪種子中共分離到3株能夠產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌,經(jīng)過ITS、GPD序列的同源性比對和遺傳進化分析,結(jié)果表明該菌株與波狀芽管蠕孢菌的親緣關(guān)系最近,根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)和遺傳進化分析結(jié)果將NM-UA001、NM-UA002、NM-UA003 3株菌鑒定為U.oxytropis。2、選取液體培養(yǎng)15d的NM-UA003菌絲,充分研磨后,使用0.6mol/L MgSO4作為緩沖液,酶解體系為纖維素酶+溶壁酶+蝸牛酶,3種酶組份的比例為1:1:1.2,室溫下90 r/min振蕩酶解2 h,U.oxytropis原生質(zhì)體的生成量最大,達到8×107～1.2×108個/mL。采用真菌表達載體pAN7、pDL2、pFL2對瘋草內(nèi)生真菌原生質(zhì)體進行體外轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后可以在再生培養(yǎng)基上生長。3、分別選用UV和EMS、NTG誘變劑對內(nèi)生真菌進行誘變,隨機挑取79株誘變處理的菌株進行富集培養(yǎng)。各菌株SW合成效率分析結(jié)果表明,UV誘變處理,共獲得6株SW產(chǎn)率發(fā)生顯著變化的突變株(P0.05);使用EMS誘變處理時,共獲得12株SW產(chǎn)率顯著變化的突變株(P0.05);使用NTG誘變處理時,共獲得8株SW產(chǎn)率發(fā)生顯著變化的突變株(P0.05)。
【學(xué)位單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S852.662
【部分圖文】：

Ｌ－哌可酸??１－氧吲哚里西啶?ｈ?？?Ｉ?（ｌＳ．８ａＳ）￣＾基吲哚里西啶??圖１－１豆類絲核菌中苦馬豆素和根霉菌胺的合成途徑ｌ４５４６ｌ??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｈｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｓｌａｆｒａｍｉｎｅ?ａｎｄ?ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ?ｉｎ?Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ?ｌｅｇｕｍｉｎｉｃｏｌａ??金龜子綠僵菌是一種寄生于動物體內(nèi)的病原，屬Ｔ半知菌亞門綠??僵菌屬。１９８５年，Ｈｉｎｏ等首次從該中分離出一種具有免疫活性的生物堿，??隨后證實該生物堿即是ＳＷ。Ｓｉｍ等Ｍ推測綠僵菌合成ＳＷ的前體物質(zhì)可能是Ｌ－賴氨酸或者Ｌ－??哌可酸，進行了更加深入的研宄，發(fā)現(xiàn)當(dāng)增加Ｌ－賴氨酸的濃度時，Ｌ－哌可酸濃度也隨著增加，ＳＷ??的合成量也增加。ａ－酮戊二酸和Ｌ－賴氨酸經(jīng)過一些列反應(yīng)后都會生成一種共同的物質(zhì)，即Ａｌ，６－??哌啶甲酸，Ａ１，６－哌啶甲酸經(jīng)轉(zhuǎn)化形成Ｌ－哌可酸，Ｌ－哌可酸在某些物質(zhì)催化作用下，最終生成ＳＷ。??因此，認力ＡｔｏａｒＷｚ／ｗ／ｗ麵＞〇／？／／此合成ＳＷ的部分路徑與／ｅｇｗＨ／？／ｃｏ／＜３相似（見圖丨－２?）。??Ｌ－賴氨酸??ａ－酮戊二酸?Ｌ－酵母氨酸??高檸檬酸?ｔｘ－氨基已二酸??？?Ａｌ

?Ｃｔ－酮己二酸?苦馬豆素??圖１－２金龜子綠僵菌中ＳＷ的合成途徑Ｉ４７】??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ?ｉｎ?Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ?ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ??Ｌ－賴氨酸和Ｌ－脈可酸是７？／７／‘Ｚ０ｍｗ／ｗ?／嘆麵／／７／（：〇／〇和６７／７／５０／？／／似合成ＳＷ的共同的??前體物質(zhì)，Ｌ－賴氨酸在酶的作用下，經(jīng)過一系列反應(yīng)都生成了?Ｌ－哌可酸，Ｌ－哌可酸再經(jīng)過反應(yīng)生??－４－??

?第二章變異黃芪中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離與鑒定??圖２－２根據(jù)ＩＴＳ序列應(yīng)用鄰接法（ＮＪ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹?‘??Ｆｉｇ．２?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｃｏｎｔｒｕｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｐｒｏｇｒａｍ?Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）ｂａｓｅｄ?ｏｎ?ＩＴＳ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ??注：比例尺代表堿基替換數(shù)；分支數(shù)字代表分類單位聚集在一起的幾率；括號中的序號為各菌株ＩＴＳ序列在ＧｅｎＢａｎｋ中的登錄號??Ｎｏｔｅ：Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ?ｂｒａｎｃｈ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｃｔｅｄ?ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｎｏｄｅｓ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔａｘａ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｒｉｇｈｔ??ａｒｅ?ｐｌａｃｅｄ?ｔｏｇｅｔｈｅｒ?ｂｙ?ｔｌｉｅ?ｐｒｏｇｒａｍ．Ｔｈｅ?ｓｅｒｉａｌ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｂｒａｃｋｅｔｓ?ａｒｅ?ＧｅｎＢａｎｋ?ａｃｃｅｓｓｉｏｎ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＩＴＳ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?ｏｆ?ｉｓｏｌａｔｅｓ??Ｕｎｄｉｆｉｌｕｍ?ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ?ＤＡＯＭ?２３７６９６??Ｕｎｄ
【參考文獻】

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本文編號：2837854