禽類輸卵管的子宮陰道交接部和傘部存在著一種特殊的管狀腺,這種腺體能使禽類精子在輸卵管內(nèi)長期存活,并且能夠長時間保持其受精力,該腺體被稱為貯精腺。禽類貯精腺能夠大量表達碳酸酐酶,且碳酸酐酶4(CAⅣ)在哺乳動物精子成熟和儲存的附睪部位大量表達,據(jù)此推測CAⅣ基因可能影響著母雞體內(nèi)精子的貯存。本試驗以雞為研究對象,參考雞CAⅣ基因序列,根據(jù)基因序列的保守區(qū)設(shè)計特異性引物,內(nèi)參基因選擇雞β-actin基因,用熒光定量分析CAⅣ基因在雞輸卵管傘部、膨大部、峽部、子宮部、子宮陰道交接部和陰道部的表達。結(jié)果表明子宮陰道交接部的CAⅣ基因表達量最高,顯著高于其他部位的表達(p0.05);傘部次之,其表達量顯著高于除子宮陰道交接部之外的其他部位(p0.05);而在其他四個部位表達量都比較低。CAⅣ基因在母雞輸卵管子宮陰道交接部和傘部位的高表達預(yù)示著其可能參與貯精腺內(nèi)的精子儲存。根據(jù)雞CAⅣ的序列以及畢赤酵母的密碼子的喜好性,合成CAⅣ基因,將CAⅣ基因克隆到p PICZαA真核表達載體中,并將重組表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至畢赤酵母菌GS115中,得到含重組質(zhì)粒的畢赤酵母菌,用終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)重組陽性菌的表達,通過SDS-PAGE電泳和His標簽蛋白表達的Western Blot檢測表達產(chǎn)物。用Ni離子親和層析純化表達產(chǎn)物,并用SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測純化后的表達產(chǎn)物。結(jié)果表明重組酵母菌能成功分泌雞CAⅣ蛋白,約為36k Da,且用Ni離子親和層析法純化可獲得純度較好的目的蛋白。在雞精液內(nèi)添加CAⅣ蛋白測定在不同的貯存時間下精液的p H值和精子活力的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著精液貯存時間的推移,兩組精液的p H值和精子活力均顯著下降(p0.05);在精液貯存的6 h、12 h和24h時,添加CAⅣ蛋白組p H值顯著低于對照組(p0.05);在精液貯存的12 h和24h時,添加CAⅣ蛋白組精子活力顯著低于對照組(p0.05)。結(jié)果表明CAⅣ蛋白可能通過調(diào)節(jié)貯精部位的p H值和精子活力來抑制精子運動。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S831
【部分圖文】：

圖 2-1 總 RNA 的質(zhì)量檢驗Fig.2-1 Organize total RNA detection results大部，C 為峽部，D 為子宮，E 為子宮陰道agnum, C is isthmus, D is uterus, E is utero-v定產(chǎn)物進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物在 2%個部位都有反轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物（圖 2-2）系和反應(yīng)條件可以用于熒光定量研究圖 2-2 CAⅣ基因反轉(zhuǎn)錄擴增結(jié)果

圖 2-1 總 RNA 的質(zhì)量檢驗Fig.2-1 Organize total RNA detection resultsB 為膨大部，C 為峽部，D 為子宮，E 為子宮陰道交接部, B is magnum, C is isthmus, D is uterus, E is utero-vagina ju的確定反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物在 2%的瓊脂管六個部位都有反轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物（圖 2-2），且條擴增體系和反應(yīng)條件可以用于熒光定量研究。

圖 2-4 CAⅣ基因在雞輸卵管不同部位中的相對表達量ig.2-4 Relative expression levels of CAⅣ mRNA in different tissues of oviduct in chicken柱狀圖上面字母相同者表示差異不顯著（p>0.05），字母不相同表示差異顯著（p<0.05）討論本試驗通過實時定量 PCR 分析 CAⅣ基因在 mRNA 水平母雞輸卵管不同部達，結(jié)果表明 CAⅣ基因的在子宮陰道交接部位表達量最高，顯著高于母雞其它部位，其次為傘部，且傘部 CAⅣ的表達含量也顯著高于除子宮陰道交其它部位，而其他四個部位之間的 CAⅣ的表達沒有差異。母禽生殖道內(nèi)的有兩個部位，一個是子宮陰道交接部，另一個是傘部，子宮陰道交接部的貯母雞貯存精子的主要場所(Froman 2003)，在此部位貯存的精子釋放并向上運部短暫貯存并在此完成受精 (King et al 1999)。CAⅣ在母雞生殖道貯存精子

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 崔成都;魯京蘭;金清誅;樸明椒;權(quán)福實;;禽類輸卵管精子腺組織學(xué)與組織化學(xué)研究[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2010年10期

2 趙翔,張梅芬;番鴨輸卵管內(nèi)貯精腺體超微結(jié)構(gòu)的觀察[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;1997年06期

本文編號：2834630