豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可以引起急性、高度接觸性腸道傳染病——豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED),近年來給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。各日齡豬均可感染PEDV,其中對哺乳仔豬的危害最為嚴重,死亡率可達90%~100%。2010年末PEDV在我國南方地區(qū)開始流行,到2014年為止我國各地區(qū)豬場都可檢出PEDV陽性。雖然國內滅活疫苗的使用在一定程度上抑制了PEDV的進一步擴散,但由于臨床中不斷有PEDV變異毒株的出現,傳統疫苗的保護效果并不理想。PEDV仍是造成仔豬流行性急性腹瀉的主要病原之一。細胞自噬(autophagy)是一種廣泛存在于真核細胞中高度保守的溶酶體依賴性降解途徑,對于維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和清除損傷的細胞器至關重要。在外源性因素刺激下,自噬也可作為一種防御機制發(fā)揮作用。有研究表明自噬與癌癥的發(fā)生、病原體感染等過程都具有密切的關系。許多病毒在感染宿主的過程中都可誘導細胞自噬的發(fā)生。為了探究PEDV CV777株感染IPEC-J2細胞誘導自噬的機制并篩選出參與誘導細胞自噬的PEDV關鍵非結構蛋白,我們展開了如下研究。首先將PEDV CV777株在IPEC-J2細胞中進行適應傳代,利用透射電鏡觀察、Western blot檢測和激光共聚焦免疫熒光等技術對PEDV是否誘導細胞自噬進行分析。結果顯示PEDV感染后IPEC-J2細胞中自噬樣雙層膜囊泡結構增多,并誘導GFP-LC3在細胞內呈顯著的點狀聚集。Western blot結果表明自噬相關標志蛋白LC3-II和Beclin-1的表達明顯上調,自噬底物標志蛋白p62則表現為降解趨勢。說明PEDV侵染IPEC-J2細胞能誘導細胞完全自噬的發(fā)生。為了深入研究PEDV復制過程中各非結構蛋白對細胞自噬的影響,構建了PEDV各非結構蛋白的真核表達質粒,轉染IPEC-J2細胞后檢測各蛋白對細胞自噬的影響。結果顯示PEDV非結構蛋白Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp8、Nsp10、Nsp14都可上調自噬相關基因LC3-II的表達,其中Nsp5和Nsp8引起的LC3-II的聚集效果極顯著。我們選取Nsp5、Nsp6和Nsp8進行誘導細胞自噬的驗證,在轉染pCMV-Nsp5、pCMV-Nsp6和pCMV-Nsp8的基礎上,以特異性小干擾RNA(siRNAs)對Nsp5、Nsp6和Nsp8的表達進行干擾。結果顯示,siRNA使Nsp5、Nsp6和Nsp8失去誘導細胞自噬的能力。此外我們發(fā)現誘導細胞自噬可促進PEDV的增殖,而抑制細胞自噬則不利于PEDV的增殖。這說明細胞自噬與PEDV的增殖也有著密切的關系。本研究證明PEDV可誘導IPEC-J2細胞自噬,而細胞自噬有利于PEDV自身的增殖,并篩選出誘導細胞自噬效果顯著的關鍵PEDV非結構蛋白Nsp5和Nsp8。本研究對于進一步探索PEDV非結構蛋白誘導細胞自噬的機制提供了理論依據和物質基礎。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

東北農業(yè)大學農學碩士學位論文行簡介。酵母細胞中大自噬與微自噬的過程示意圖見圖 1-2。大自噬的四個主要的步驟：（1）起始：在內源性或外源性刺激下，與上游能量感K 連接的 ULK1 復合物引起細胞自噬的激活。（2）自噬體的延伸：自噬體 phagophore 膜的擴張和延伸產生，雖然 phagophore 的起源目前仍有爭議內質網、線粒體、高爾基體等在內的細胞器膜都有助于自噬體膜形成[96體膜的閉合及自噬體與溶酶體融合的過程需要由 GTP 和 SNARE 蛋白家是在自噬體膜閉合之前除 LC3 外其他 Atg 蛋白都會從膜上脫離。（4）降融合后自噬膜內包裹的待降解底物被溶酶體內含有的水解酶給降解并被

圖 3-2 PEDV 在 IPEC-J2 細胞中的生長曲線Fig. 3-2 The growth curve of PEDV in IPEC-J2 cells免疫熒光檢測 PEDV 感染 IPEC-J2 細胞證 PEDV 能否感染 IPEC-J2 細胞，并觀察不同濃度 PEDV 感染 IPEC--J2 細胞接種于 24 孔板中，待細胞鋪滿單層后用不同濃度的 PEDV 感正常細胞作為陰性對照組。感染后 36 h 以 PEDV 全病毒多抗為一抗進IFA）來檢測 PEDV 在細胞內的復制情況。如圖 3-3 所示，在對照組觀察到熒光信號，0.01 MOI 的 PEDV 感染 IPEC-J2 細胞僅可觀察到少，隨著病毒濃度的增大，熒光信號的強度也隨之增強。1 MOI 的 PED強于 0.1 MOI 的 PEDV，因此后續(xù)實驗中 PEDV 感染 IPEC-J2 細胞的

在對照組細胞中（圖3-4 A）沒有觀察到熒光信號，0.01 MOI 的 PEDV 感染 IPEC-J2 細胞僅可觀察到少量熒光信號（圖 3-4 B），隨著病毒濃度的增大，熒光信號的強度也隨之增強。1 MOI 的 PEDV 感染細胞的能力明顯強于 0.1 MOI 的 PEDV，因此后續(xù)實驗中 PEDV 感染 IPEC-J2 細胞的濃度都選用1 MOI。

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本文編號：2833740