豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可以引起急性、高度接觸性腸道傳染病——豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED),近年來給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。各日齡豬均可感染PEDV,其中對哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重,死亡率可達(dá)90%~100%。2010年末PEDV在我國南方地區(qū)開始流行,到2014年為止我國各地區(qū)豬場都可檢出PEDV陽性。雖然國內(nèi)滅活疫苗的使用在一定程度上抑制了PEDV的進(jìn)一步擴散,但由于臨床中不斷有PEDV變異毒株的出現(xiàn),傳統(tǒng)疫苗的保護效果并不理想。PEDV仍是造成仔豬流行性急性腹瀉的主要病原之一。細(xì)胞自噬(autophagy)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中高度保守的溶酶體依賴性降解途徑,對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和清除損傷的細(xì)胞器至關(guān)重要。在外源性因素刺激下,自噬也可作為一種防御機制發(fā)揮作用。有研究表明自噬與癌癥的發(fā)生、病原體感染等過程都具有密切的關(guān)系。許多病毒在感染宿主的過程中都可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。為了探究PEDV CV777株感染IPEC-J2細(xì)胞誘導(dǎo)自噬的機制并篩選出參與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的PEDV關(guān)鍵非結(jié)構(gòu)蛋白,我們展開了如下研究。首先將PEDV CV777株在IPEC-J2細(xì)胞中進(jìn)行適應(yīng)傳代,利用透射電鏡觀察、Western blot檢測和激光共聚焦免疫熒光等技術(shù)對PEDV是否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)行分析。結(jié)果顯示PEDV感染后IPEC-J2細(xì)胞中自噬樣雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)增多,并誘導(dǎo)GFP-LC3在細(xì)胞內(nèi)呈顯著的點狀聚集。Western blot結(jié)果表明自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白LC3-II和Beclin-1的表達(dá)明顯上調(diào),自噬底物標(biāo)志蛋白p62則表現(xiàn)為降解趨勢。說明PEDV侵染IPEC-J2細(xì)胞能誘導(dǎo)細(xì)胞完全自噬的發(fā)生。為了深入研究PEDV復(fù)制過程中各非結(jié)構(gòu)蛋白對細(xì)胞自噬的影響,構(gòu)建了PEDV各非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞后檢測各蛋白對細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果顯示PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp8、Nsp10、Nsp14都可上調(diào)自噬相關(guān)基因LC3-II的表達(dá),其中Nsp5和Nsp8引起的LC3-II的聚集效果極顯著。我們選取Nsp5、Nsp6和Nsp8進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的驗證,在轉(zhuǎn)染pCMV-Nsp5、pCMV-Nsp6和pCMV-Nsp8的基礎(chǔ)上,以特異性小干擾RNA(siRNAs)對Nsp5、Nsp6和Nsp8的表達(dá)進(jìn)行干擾。結(jié)果顯示,siRNA使Nsp5、Nsp6和Nsp8失去誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的能力。此外我們發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可促進(jìn)PEDV的增殖,而抑制細(xì)胞自噬則不利于PEDV的增殖。這說明細(xì)胞自噬與PEDV的增殖也有著密切的關(guān)系。本研究證明PEDV可誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞自噬,而細(xì)胞自噬有利于PEDV自身的增殖,并篩選出誘導(dǎo)細(xì)胞自噬效果顯著的關(guān)鍵PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp5和Nsp8。本研究對于進(jìn)一步探索PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機制提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文行簡介。酵母細(xì)胞中大自噬與微自噬的過程示意圖見圖 1-2。大自噬的四個主要的步驟：（1）起始：在內(nèi)源性或外源性刺激下，與上游能量感K 連接的 ULK1 復(fù)合物引起細(xì)胞自噬的激活。（2）自噬體的延伸：自噬體 phagophore 膜的擴張和延伸產(chǎn)生，雖然 phagophore 的起源目前仍有爭議內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體等在內(nèi)的細(xì)胞器膜都有助于自噬體膜形成[96體膜的閉合及自噬體與溶酶體融合的過程需要由 GTP 和 SNARE 蛋白家是在自噬體膜閉合之前除 LC3 外其他 Atg 蛋白都會從膜上脫離。（4）降融合后自噬膜內(nèi)包裹的待降解底物被溶酶體內(nèi)含有的水解酶給降解并被

圖 3-2 PEDV 在 IPEC-J2 細(xì)胞中的生長曲線Fig. 3-2 The growth curve of PEDV in IPEC-J2 cells免疫熒光檢測 PEDV 感染 IPEC-J2 細(xì)胞證 PEDV 能否感染 IPEC-J2 細(xì)胞，并觀察不同濃度 PEDV 感染 IPEC--J2 細(xì)胞接種于 24 孔板中，待細(xì)胞鋪滿單層后用不同濃度的 PEDV 感正常細(xì)胞作為陰性對照組。感染后 36 h 以 PEDV 全病毒多抗為一抗進(jìn)IFA）來檢測 PEDV 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。如圖 3-3 所示，在對照組觀察到熒光信號，0.01 MOI 的 PEDV 感染 IPEC-J2 細(xì)胞僅可觀察到少，隨著病毒濃度的增大，熒光信號的強度也隨之增強。1 MOI 的 PED強于 0.1 MOI 的 PEDV，因此后續(xù)實驗中 PEDV 感染 IPEC-J2 細(xì)胞的

在對照組細(xì)胞中（圖3-4 A）沒有觀察到熒光信號，0.01 MOI 的 PEDV 感染 IPEC-J2 細(xì)胞僅可觀察到少量熒光信號（圖 3-4 B），隨著病毒濃度的增大，熒光信號的強度也隨之增強。1 MOI 的 PEDV 感染細(xì)胞的能力明顯強于 0.1 MOI 的 PEDV，因此后續(xù)實驗中 PEDV 感染 IPEC-J2 細(xì)胞的濃度都選用1 MOI。

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本文編號：2833740