ALDH1A1為乙醛脫氫酶(ALDH)基因超家族成員之一,是參與視黃醛代謝、促進(jìn)維甲酸代謝通路的活化和調(diào)控脂肪酸代謝通路的關(guān)鍵基因之一。本試驗(yàn)將ALDH1A1基因構(gòu)建到PMD18-T載體上,克隆延黃牛ALDH1A1基因cDNA序列,利用生物信息學(xué)軟件分析該基因理化性質(zhì)及其蛋白結(jié)構(gòu),并通過qRT-PCR技術(shù)檢測ALDH1A1基因在延黃牛各個(gè)組織間的表達(dá)差異。結(jié)果顯示:延黃牛ALDH1A1基因共編碼501個(gè)氨基酸,理論等電點(diǎn)為7.16,屬于堿性氨基酸,在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮主要作用;不是分泌性蛋白,屬于親水性蛋白,存在31個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn);蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示4種結(jié)構(gòu),分別是α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。ALDH1A1基因在肝、胃、皮下脂肪、十二指腸和腎組織中表達(dá)極顯著(P0.01),在背最長肌中顯著表達(dá)(P0.05)。利用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了延黃牛ALDH1A1基因的siRNA干擾和過表達(dá)載體,再由脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到體外分離的延黃牛前體脂肪細(xì)胞中,利用qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印記檢測ALDH 1A1基因mRN A和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:ALDH1A1、LPL和成脂關(guān)鍵基因(C/EBPα和PPARγ),在誘導(dǎo)延黃牛前體脂肪細(xì)胞分化時(shí)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。ALDH1A1基因干擾組在誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化的第0、4和9天中,呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢(shì);而過表達(dá)組在誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化的第0、4和9天中,呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì);ALDH1A1基因的過表達(dá)能顯著促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞脂滴和甘油三酯的生成,同時(shí)還顯著促進(jìn)LPL和成脂關(guān)鍵因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá),而ALDH1A1基因的干擾則與其相反,顯著降低脂肪細(xì)胞脂滴及甘油三酯含量的生成,且顯著抑制LPL和成脂關(guān)鍵因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá)。研究表明ALDH1A1基因參與前體脂肪細(xì)胞分化的過程。為了進(jìn)一步探索ALDH1A1基因的功能,本研究以99頭18月齡的延黃牛母牛為試驗(yàn)對(duì)象,通過測序的方法篩查ALDH1A1基因的多態(tài)位點(diǎn),再分析其與延黃牛肉用性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示:延黃牛ALDH1A1基因13個(gè)外顯子中只有外顯子4和11中檢測到突變位點(diǎn)。外顯子4在Chr9.49381142處存在T/G的突變且引起編碼氨雄酸絡(luò)氨酸的改變。外顯子11在Chr9.49361243處存在T/A的突變,未引起編碼氨基酸發(fā)生改變。內(nèi)含子4在Chr9.49381356處存在G/T的突變。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示:ALDH1A1基因外顯子4 TT基因型與延黃牛肉用性狀中的十字部高、胸圍、腹圍、管圍和背膘厚存在顯著相關(guān)(P0.05),與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性(P0.056);ALDH1A1基因外顯子11 AA基因型與延黃牛肉用性狀中的十字部高、官圍、體重和背膘厚存在顯著相關(guān)(P0.05)。綜上所述,本研究成功克隆獲得延黃牛ALDH1A1基因編碼區(qū)序列,并研究該基因在延黃牛各組織間的表達(dá)差異以及對(duì)脂代謝的影響和遺傳多態(tài)性分析,為開展延黃牛ALDH1A1基因的功能及肉質(zhì)基因篩選的工作提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S823.81
【部分圖文】：

２．３．邋１總ＲＮＡ電泳檢測結(jié)果逡逑對(duì)各組織總ＲＮＡ進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像儀下觀察，提取的ＲＮＡ逡逑完整性較好（見圖２．１），其Ｄ２６Ｇｎｎｉ／Ｄ２８（）ｎｍ值均在２．０左右，說明ＲＮＡ提取質(zhì)量逡逑較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。逡逑１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８逡逑—Ｉ、逡逑圖２．邋１邋ＫＮＡ瓊脂糖凝膠電泳圖逡逑注；１，２，邋３，邋４，邋５，６，，７，邋８分別表樂心、肝、肺、賢、捋、ｆ邋：指腸、皮下脂肪和竹eA長肌。逡逑Ｆｉｇ．邋２．邋１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＲＮＡ逡逑Ｎｏｔｅ；邋１，２，３，４．５，６．７，８邋ｄｅｎｏｔｅｓ邋ｈｅａｒｔ，邋ｌｉｖｅｒ，邋ｌｕｎｇ，邋ｋｉｄｎｅｙ，邋ｓｔｏｍａｃｈ，邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，邋ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋ｆａｔ．邋ａｎｄ邋ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ邋ｄｏｒｓｉ．逡逑２．邋３．邋２邋ＡＬＤＨ〗Ａ１基因克隆結(jié)果逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１．０邋％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＡＬＤＨ１Ａ丨甚因ＣＤＳ片段逡逑長１５０６邋ｂｐ，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，條帶明亮可用于切膠純化，如圖２．２所逡逑示。按照ＡＬＤＨ１Ａ１基因擴(kuò)增的引物和反應(yīng)條件進(jìn)行菌落ＰＣＲ擴(kuò)增鑒定。所得逡逑條帶長度為載體中插入的目的片段長度１５０６邋ｂｐ，條帶明亮且無雜帶如圖２．３所逡逑示。逡逑１５逡逑

２．３．７延黃牛ＡＬＤＨ１Ａ１蛋白信號(hào)肽預(yù)測逡逑通過ＳｉｇｎａｌＰ軟件預(yù)測延黃牛ＡＬＤＨ１Ａ】蛋白信號(hào)肽，結(jié)p}顯小該蛋門在逡逑４６３處存在一個(gè)剪切位點(diǎn)Ｃ，在１８６處存在一個(gè)峭的位置Ｓ邋（如閣２．８所示），逡逑該處Ｓ值只有０．４４８，不是信號(hào)肽￣亞細(xì)胞分析結(jié)果－致不屬于分泌性蛋白質(zhì)見逡逑表邋２．６。逡逑表２．６延黃牛ＡＬＤＨ邋１ＡＩ蛋白信號(hào)肽預(yù)測數(shù)值逡逑Ｔａｈｌｅ．２．６邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ邋Ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ＡＬＤＨ邋１Ａ１邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｓｉｇｎａｌ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｎ邋Ｙａｎｈｕａｎｇ邋Ｃａｔｔｌｅ逡逑測量邋Ｍｅａｓｕｒｅ邐位置邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邐ｔｆｉ邋Ｖａｌｕｅ邐截止邐Ｃｕｔｏｆｆ邐信號(hào)肽邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅｖ逡逑Ｃ－ｍａｘ邐４６３邐０．１６５邐０．３２邐ＮＯ逡逑Ｙ－ｍａｘ邐１８６邐０．１２９邐０．３３邐ＮＯ逡逑Ｓ－ｍａｘ邐１邐０．４４８邐０．８７邐ＮＯ逡逑Ｓ－ｍｅａｎ邐１－１８５邐０．０２６邐０．４８邐ＮＯ逡逑Ｄ邐１－１８５邐０．０７７邐０．４３邐ＮＯ逡逑注：Ｓ足峰值；Ｃ是剪切位點(diǎn)；Ｙ足Ｓ值和Ｃ值的一個(gè)參數(shù)；Ｓ－ｍｃａｎ坫從Ｎ端氨貓酸Ｉｆ始到�。浊形稽c(diǎn)處各逡逑魏儕酸的ｆ均Ｓ值；Ｄ是Ｓ－ｍｅａｎ和Ｙ－ｍａｘ的ｆ均饑。逡逑－

２．３．７延黃牛ＡＬＤＨ１Ａ１蛋白信號(hào)肽預(yù)測逡逑通過ＳｉｇｎａｌＰ軟件預(yù)測延黃牛ＡＬＤＨ１Ａ】蛋白信號(hào)肽，結(jié)p}顯小該蛋門在逡逑４６３處存在一個(gè)剪切位點(diǎn)Ｃ，在１８６處存在一個(gè)峭的位置Ｓ邋（如閣２．８所示），逡逑該處Ｓ值只有０．４４８，不是信號(hào)肽￣亞細(xì)胞分析結(jié)果－致不屬于分泌性蛋白質(zhì)見逡逑表邋２．６。逡逑表２．６延黃牛ＡＬＤＨ邋１ＡＩ蛋白信號(hào)肽預(yù)測數(shù)值逡逑Ｔａｈｌｅ．２．６邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ邋Ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ＡＬＤＨ邋１Ａ１邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｓｉｇｎａｌ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｎ邋Ｙａｎｈｕａｎｇ邋Ｃａｔｔｌｅ逡逑測量邋Ｍｅａｓｕｒｅ邐位置邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邐ｔｆｉ邋Ｖａｌｕｅ邐截止邐Ｃｕｔｏｆｆ邐信號(hào)肽邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅｖ逡逑Ｃ－ｍａｘ邐４６３邐０．１６５邐０．３２邐ＮＯ逡逑Ｙ－ｍａｘ邐１８６邐０．１２９邐０．３３邐ＮＯ逡逑Ｓ－ｍａｘ邐１邐０．４４８邐０．８７邐ＮＯ逡逑Ｓ－ｍｅａｎ邐１－１８５邐０．０２６邐０．４８邐ＮＯ逡逑Ｄ邐１－１８５邐０．０７７邐０．４３邐ＮＯ逡逑注：Ｓ足峰值；Ｃ是剪切位點(diǎn)；Ｙ足Ｓ值和Ｃ值的一個(gè)參數(shù)；Ｓ－ｍｃａｎ坫從Ｎ端氨貓酸Ｉｆ始到�。浊形稽c(diǎn)處各逡逑魏儕酸的ｆ均Ｓ值；Ｄ是Ｓ－ｍｅａｎ和Ｙ－ｍａｘ的ｆ均饑。逡逑－

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 左其生;張蕾;連超;肖天榮;王穎潔;湯貝貝;王飛;紀(jì)艷芹;路鎮(zhèn)宇;趙瑞峰;張文慧;張亞妮;李碧春;;脂代謝通路對(duì)雞雄性生殖細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年22期

2 李彩霞;吳朝霞;王立順;;醛脫氫酶超家族研究進(jìn)展[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年06期

3 呂愛輝;;“延黃�！钡目茖W(xué)發(fā)展之路[J];科學(xué)大觀園;2010年02期

4 余梅;毛華明;黃必志;;牛肉品質(zhì)的評(píng)定指標(biāo)及影響牛肉品質(zhì)的因素[J];中國畜牧獸醫(yī);2007年02期

5 張喜凡,楊廣林;建立良種肉牛繁育體系的技術(shù)問題[J];遼寧畜牧獸醫(yī);2000年04期

本文編號(hào)：2833575