禽流感(Avian influenza,AI)是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展和人類(lèi)健康的一種重要疫病,其中H9N2亞型禽流感在我國(guó)呈地方流行性,具有經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生意義�，F(xiàn)有的H9N2亞型禽流感疫苗主要采用流行毒株研制成的油乳滅活苗,但這類(lèi)滅活疫苗抗原譜窄,不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和黏膜免疫,難以應(yīng)對(duì)禽流感病毒抗原的快速變異。近些年的一些研究發(fā)現(xiàn),部分已進(jìn)行疫苗接種的養(yǎng)殖場(chǎng)依然經(jīng)常暴發(fā)H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的感染。之后的研究進(jìn)一步證實(shí),該現(xiàn)象是由于H9N2亞型AIV不斷地發(fā)生變異而導(dǎo)致抗原性發(fā)生改變所引起的,因此有必要對(duì)H9N2亞型AIV的疫苗株進(jìn)行更新并開(kāi)展新型疫苗的研制。本研究以實(shí)驗(yàn)室培育的一株H9N2亞型AIV冷適應(yīng)株TX-25-CE30為骨架,通過(guò)拯救條件的摸索,將其HA、NA基因替換為母本株TX的對(duì)應(yīng)片段,構(gòu)建了“6+2”模式的冷適應(yīng)致弱重組毒株,另外,將其N(xiāo)S基因替換為NS1基因缺失的片段,構(gòu)建了冷適應(yīng)聯(lián)合NS1基因缺失的雙重致弱毒株,評(píng)價(jià)了構(gòu)建毒株的生物學(xué)特性,并對(duì)其免疫效力進(jìn)行了評(píng)價(jià),為禽流感疫苗的研制提供了新的思路。1 H9N2亞型禽流感病毒冷適應(yīng)株的冷適應(yīng)、溫度敏感表型相關(guān)基因鑒定為了鑒定實(shí)驗(yàn)室所培育的H9N2亞型AIV冷適應(yīng)毒株與冷適應(yīng)特性、溫度敏感性相關(guān)的關(guān)鍵基因,利用PR8骨架,將冷適應(yīng)毒株TX-25-CE30各基因的表達(dá)質(zhì)粒逐一替換PR8的相應(yīng)基因,轉(zhuǎn)染293T和MDCK共培養(yǎng)細(xì)胞,共獲得8個(gè)重組病毒。對(duì)重組病毒進(jìn)行的冷適應(yīng)特性、溫度敏感性鑒定試驗(yàn)表明NP基因?qū)溥m應(yīng)特性起最關(guān)鍵作用,NA基因?qū)溥m應(yīng)特性有一定作用。PB2、NP基因?qū)囟让舾行云鹱铌P(guān)鍵作用,PB1、M基因?qū)囟让舾行杂幸欢ㄗ饔�。以TX為骨架,將其N(xiāo)P基因替換為冷適應(yīng)株NP基因,拯救得到重組毒rTX-25-NP,同時(shí)將其N(xiāo)S基因替換為NS1基因缺失程度不同的片段得到重組毒rTX-25-NP-NS1-73、rTX-25-NP-NS1-128,這些帶有冷適應(yīng)株 TX-25-CE30 的 NP 基因的重組毒,沒(méi)有獲得明顯的冷適應(yīng)特性及溫度敏感性。因此,冷適應(yīng)株TX-25-CE30的冷適應(yīng)特性及溫度敏感性是多個(gè)內(nèi)部基因的協(xié)同作用。2 H9N2亞型禽流感病毒冷適應(yīng)株拯救條件的探索測(cè)定冷適應(yīng)株TX-25-CE30在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力,結(jié)果表明其在常見(jiàn)的拯救流感病毒用細(xì)胞293T、MDCK、Vero、COS-1上的復(fù)制均較差,在雞胚成纖維細(xì)胞上的復(fù)制能力較好,在可傳代的雞成纖維細(xì)胞系DF-1上也有一定的復(fù)制能力。TX-25-CE30在33℃,2μg/mL TPCK胰酶濃度條件下在293T、DF-1上的復(fù)制能力最佳。在33℃條件下,冷適應(yīng)株在雞胚中復(fù)制滴度最高。將表達(dá)H9N2亞型冷適應(yīng)減毒株TX-25-CE30基因的8個(gè)質(zhì)粒,按照優(yōu)化條件共轉(zhuǎn)染293T和DF-1共培養(yǎng)細(xì)胞,成功獲得重組毒株rTX-25-CE3Q,該病毒與母本毒株一樣,具有冷適應(yīng)特性及溫度敏感性。3冷適應(yīng)和NS截短致弱的重組H9N2亞型禽流感病毒的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)以冷適應(yīng)株TX-25-CE30內(nèi)部基因?yàn)楣羌?通過(guò)第二章建立的反向遺傳平臺(tái),成功拯救出HA、NA基因替換為T(mén)X株的重組毒株,命名為rTXca-HA-NA;成功拯救出冷適應(yīng)聯(lián)合NS1基因缺失的雙重致弱重組毒,其HA、NA基因來(lái)源于母本株TX,NS基因?yàn)镹S1N端保留73位氨基酸的缺失片段,其余內(nèi)部基因來(lái)自冷適應(yīng)株TX-25-CE30,命名為rTXca HA-NA-NS73。rTXca-HA-NA-NS73免疫雞后,無(wú)法在氣管和肺組織中檢測(cè)到病毒。rTXca-HA-NA僅有1只雞可以在感染病毒后第5天在肺組織中檢測(cè)到,其余雞無(wú)法在氣管和肺中檢測(cè)到病毒。rTX-NS1-73可以在雞氣管檢測(cè)到低水平復(fù)制滴度;在肺組織中,只有接種后第3天在1只雞檢測(cè)到低水平復(fù)制滴度,其余雞沒(méi)有在肺中檢測(cè)到病毒。重組母本毒rTX在氣管和肺中檢測(cè)到的復(fù)制滴度最高。rTXca-HA-NA、rTXca-HA-NA-NS73 2種病毒接種組雞可以通過(guò)喉頭排毒,但幾乎不能通過(guò)泄殖腔排毒,且這兩種病毒均喪失了接觸傳播能力。rTX-NS1-73組雞可以通過(guò)喉頭排毒,但不能通過(guò)泄殖腔排毒。rTX-NS1-73并未喪失接觸傳播能力,接觸雞可在接觸后第3、5天通過(guò)喉頭排毒,但不能通過(guò)泄殖腔排毒,在接觸后21天,接觸雞均出現(xiàn)了血清陽(yáng)轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。重組母本毒rTX接種雞可以通過(guò)喉頭、泄殖腔排毒。rTX存在接觸傳播能力,接觸雞可通過(guò)喉頭、泄殖腔排毒。3種致弱毒株rTX-NS1-73、rTX ca-HA-NA、rTX ca-HA-NA-NS73在免疫雞后均可誘導(dǎo)雞產(chǎn)生較高的HI抗體水平。以母本毒rTX攻毒,rTX ca-HA-NA提供了 100%的排毒保護(hù),rTX ca-HA-NA-NS73提供了 90%的喉頭排毒保護(hù);100%泄殖腔排毒保護(hù);rTX-NS1-73提供了 100%喉頭排毒保護(hù)及75%泄殖腔排毒保護(hù)。以抗原差異較大的YZ-C進(jìn)行攻毒,rTXca-HA-NA、rTXca-HA-NA-NS73、rTX-NS1-73不能有效阻止病毒通過(guò)喉頭排出,但可以顯著減少泄殖腔排毒。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S858.31
【部分圖文】：

一步細(xì)分為不同的亞型。季節(jié)性流感流行是由Ａ型流感和Ｂ型流感病毒引起的，而Ａ型逡逑流感病毒則是造成流感大流行的主要病原。流感病毒是有囊膜的負(fù)鏈分節(jié)段ＲＮＡ病毒，逡逑具有兩種表面糖蛋白基因和六種內(nèi)部蛋白基因（圖１－１）。表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ使病毒能逡逑夠結(jié)合、進(jìn)入和脫離被感染細(xì)胞。ＨＡ三聚體蛋白具有球狀頭部區(qū)域，其具有唾液酸受體逡逑結(jié)合位點(diǎn)，使病毒能夠附著于宿主細(xì)胞。球狀頭部上這些受體結(jié)合位點(diǎn)的突變導(dǎo)致其結(jié)合逡逑能力的改變；而抗原表位的變異產(chǎn)生了導(dǎo)致季節(jié)性流感暴發(fā)的抗原漂移的病毒株。在不可逡逑預(yù)測(cè)的時(shí)間段，不同亞型Ａ型流感病毒可經(jīng)歷基因重配以產(chǎn)生新的病毒株，其能夠在未免逡逑疫的群體中引起流感大流行。一旦引起大流行的流感病毒株出現(xiàn)，它通常取代先前流行的逡逑相同亞型的Ａ型流感病毒株，如２００９邋ＨｌＮｌｐｄｍ０９病毒。此外，人類(lèi)與Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９或逡逑Ｈ９Ｎ２亞型禽流感病毒感染的家禽密切接觸后可引起感染，但禽流感病毒迄今仍未獲得在逡逑人類(lèi)之間接觸傳播的能力［１］。逡逑目前，疫苗接種仍是預(yù)防流感最有效的途徑，流感疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗。逡逑滅活疫苗的使用有長(zhǎng)達(dá)５０余年歷史

縮短疫苗制造時(shí)間，研發(fā)針對(duì)流感病毒有效的通用疫苗，并開(kāi)展疫苗儲(chǔ)備。逡逑每年針對(duì)目標(biāo)群體批準(zhǔn)推薦的流感疫苗有滅活疫苗，或者近年來(lái)研制的減毒活疫苗。逡逑目前較為新穎的疫苗有ＤＮＡ疫苗及合成肽疫苗（圖１－２）。滅活疫苗包括病毒裂解疫苗和逡逑全病毒滅活苗。根據(jù)血凝素的量使疫苗標(biāo)準(zhǔn)化，通常每種毒株的量為１５邋的ＨＡ，用于逡逑老年人的高劑量疫苗最近也獲得了許可，每種毒株的量為６０邋ｐｇ邋ＨＡＷ。水包油類(lèi)的佐劑可逡逑以增加疫苗的免疫原性，同時(shí)可以節(jié)約流行病毒疫苗的用量％。滅活疫苗具有極佳的安全逡逑性，６月齡以上的兒童、老年人，哮喘病患者和其他高危人群均建議使用。逡逑Ｗ逡逑邐邋＃邋■邋＂邋邐逡逑ＤＮＡ邐ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ邐ｓｕｂｕｎｉｔ逡逑］ｉｎ，Ｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓ邐ｆ＼逡逑 郵邐％？汐逡逑ｓｐｌｉｔ邋ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓ邐ｖｉｒｉｏｎ邋ｌｉｋｅ邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ逡逑r>曑，逡逑ｗｈｏｌｅ邋ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓ邐ｌｉｖｅ邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ邐ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ邋ｖｉｒｕｓ逡逑ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓ邋（ＬＡＩＶ）逡逑圖１－２流感疫苗的不同組成（引自ＳａｒａｎｙａＳｒｉｄｈａｒ，２０１５）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｉｎ

流感病毒的最適培養(yǎng)溫度為３３°Ｃ，在較高的溫度（２３８°Ｃ）病毒復(fù)制將受到抑制，病毒不逡逑能進(jìn)行增殖。因此當(dāng)人感染病毒后，該病毒僅能在上呼吸道復(fù)制，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、逡逑體液免疫及細(xì)胞免疫等保護(hù)作用（圖１－４），卻不能在下呼吸道（一般發(fā)燒的病人其下呼吸逡逑道的溫度為３８？４０°Ｃ）復(fù)制，這樣就不會(huì)引起肺部感染等并發(fā)癥，表現(xiàn)出良好的安全性及逡逑有效性［１３］。逡逑在接下來(lái)的２５年中，減毒的Ａ／Ｈｌ，Ａ／Ｈ３和Ｂ型分離株在成人和兒童中進(jìn)行了詳逡逑細(xì)研宄，各項(xiàng)研宄結(jié)果證明它們單獨(dú)或合并成三價(jià)候選疫苗時(shí)具有良好的耐受性、免疫原逡逑性和有效性。１９９５邋年，Ａｖｉｒｏｎ邋（現(xiàn)為邋Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ邋Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，邋Ｍａｒｙｌａｎｄ）與國(guó)逡逑家過(guò)敏和傳染病研究所合作，并通過(guò)與密歇根大學(xué)簽訂的許可協(xié)議，獲得了開(kāi)發(fā)ＬＡＩＶ的逡逑權(quán)利［１４］。在１９９７－１９９８流感季節(jié)，對(duì)＞邋３０００名兒童進(jìn)行了雙盲，安慰劑對(duì)照研宄／ＬＡＩＶ逡逑對(duì)流感感染的保護(hù)率＞邋９０％［１５］。Ａｖｉｒｏｎ于２０００年向美國(guó)食品藥品管理局申請(qǐng)執(zhí)照，并于逡逑２００３年批準(zhǔn)ＬＡＩＶ上市用于５至４９歲的兒童和成人。為了獲得產(chǎn)品批準(zhǔn)

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