發(fā)布時間：2020-10-09 07:35

　　 近年來,由于抗生素的濫用,導致鴨疫里默氏桿菌的四環(huán)素耐藥株逐漸增多,而目前對于鴨疫里默氏桿菌四環(huán)素耐藥性的研究多偏向于藥敏實驗或流行性分析,對鴨疫里默氏桿菌四環(huán)素耐藥基因和耐藥機制鮮有報道。通過比較基因組及生物信息學分析發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌血清1型野生株CH3基因組中含有一個編碼RND家族外排泵基因M949_RS06330,其上游序列存在一個四環(huán)素阻遏蛋白Tet R蛋白(M949_RS06320)以及I型分泌系統(tǒng)TolC家族蛋白(M949_RS06325)。因此推斷這三個基因組成了一個與四環(huán)素耐藥相關(guān)的功能區(qū)。本研究利用生物信息學軟件對M949_RS06330進行了基因分析及相關(guān)調(diào)控研究;借助大腸桿菌原核表達系統(tǒng)及單克隆抗體技術(shù),對M949_RS06330進行了原核表達并制備了其單克隆抗體;以四環(huán)素類藥物中的四環(huán)素及替加環(huán)素為代表,通過熒光定量PCR及Western Blot技術(shù),探究了四環(huán)素類藥物對M949_RS06330以及M949_RS06320、M949_RS06325基因表達的影響。1.M949_RS06330的生物信息學分析檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的鴨疫里默氏桿菌基因組序列,進行M949_RS06330同源蛋白多重序列比對和進化樹分析。結(jié)果表明,M949_RS06330與黃桿菌(Flavobacteriaceae bacterium)、金黃桿菌(Chryseobacterium)等同源蛋白親緣關(guān)系較近,與鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium mizutaii)、乳酸乳桿菌(Sphingobacterium lactis)等同源蛋白親緣關(guān)系較遠;現(xiàn)有公開發(fā)表的31株鴨疫里默氏桿菌全基因組序列中,僅在2型(RA-CH-2、RA Yb2、RA-GD、RA DSM 15868、RA-YM)及1型(RA-CH-1、CH3)鴨疫里默氏桿菌基因組中比對到M949_RS06330同源蛋白;針對本實驗室從全國各地規(guī)�；唸鍪占镍喴呃锬蠗U菌進行M949_RS06330同源基因調(diào)查,發(fā)現(xiàn)有16株具有該基因,經(jīng)測序比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn),M949_RS06330在2型及15型血清型的菌株中有較好的保守性,但在血清1型中差別較為明顯,可分為兩支。綜合以上分析,可以推斷M949_RS06330可能并不是鴨疫里默氏桿菌固有結(jié)構(gòu)基因,而是在長期進化過程中所獲得的外源基因。2.M949_RS06330的原核表達及其單克隆抗體的制備將基因M949_RS06330全長序列插入pET28a載體中,構(gòu)建pET28a-M949_RS06330重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主菌BL21(DE3)中,加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)37℃小量誘導表達6h,進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果獲得預期大小的M949_RS06330重組蛋白。將M949_RS06330重組蛋白大量表達,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,蛋白主要表達在上清。上清蛋白純化后,作為免疫原等體積包裹弗氏完全佐劑,注射8周齡BALB/C小鼠,經(jīng)過三次免疫和效價檢測,選取效價最高的小鼠超免,超免后取該小鼠的脾細胞與SP2/0雜交瘤細胞融合。三次亞克隆后篩選出一株分泌特異性抗體的單克隆細胞株1E11。然后制備腹水以大量生產(chǎn)該單克隆抗體。1E11單抗亞型鑒定表明該單克隆抗體輕鏈為k,重鏈為IgG2b;ELISA檢測該單抗效價達到1:2048000;Western blot檢測該單抗特異性,結(jié)果顯示該單抗特異性良好。3.四環(huán)素類藥物對M949_RS06330調(diào)控作用研究在培養(yǎng)基中分別添加0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL的替加環(huán)素和四環(huán)素,以不加任何藥物的CH3菌液作為空白對照。設(shè)計M949_RS06320、M949_RS06325和M949_RS06330的q-RT PCR特異性引物,以鴨疫里默氏桿菌16srRNA為內(nèi)參基因,采用熒光定量PCR方法檢測不同濃度梯度的替加環(huán)素和四環(huán)素對M949_RS06320、M949_RS06325和M949_RS06330 mRNA表達的影響。按照2~((-ΔΔCt))相對定量PCR法計算分析結(jié)果,用GraphPad Prism 5軟件作圖。結(jié)果表明:替加環(huán)素、四環(huán)素對這三種基因mRNA水平呈現(xiàn)明顯誘導作用;利用制備的M949_RS06330單抗,Western blot檢測不同濃度的替加環(huán)素和四環(huán)素對M949_RS06330蛋白表達的影響,結(jié)果表明替加環(huán)素和四環(huán)素對M949_RS06330蛋白有明顯誘導作用,與熒光定量PCR結(jié)果一致。
【學位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

Fig.1-1 The method of PCR product gel recovery1.2.2.6 pET28a-M949_RS06330 原核表達載體的構(gòu)建使用 BamH I 和 EcoR I 兩種限制性內(nèi)切酶按如下體系分別酶切目的基因和pET28a 載體。37℃恒溫水浴酶切 3h。反應(yīng)液組分 體積BamH I 1μLEcoR I 1μL10×K buffer 2μLpET28a 載體 6μLddH2O 10μLTotal 20μL反應(yīng)液組分 體積BamH I 1μLEcoR I 1μL10×K buffer 2μL目的基因 8μLddH2O 8μLTotal 20μL圖 1-1 PCR 產(chǎn)物膠回收方法

14Fig.1-2 Extraction of recombinant plasmids1.2.2.10 重組蛋白的原核表達將構(gòu)建并測序正確的重組質(zhì)粒用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至卡那霉素抗性的 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，參照 1.2.2.7 的方法進行 PCR 鑒定。（1）將鑒定成功的含有重組質(zhì)粒的菌液和含有pET28a空載的菌液分別接種于卡那抗性 LB 中過夜培養(yǎng)（2）將搖好的菌液以 1:100 的比例加到卡那抗性 LB 中，37℃恒溫振搖培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8（3）以 1:1000 的比例加入 IPTG，37℃恒溫振搖 6h（4）將菌體于 4℃，10000rpm 離心 3min，棄上清圖 1-2 重組質(zhì)粒小量提取方法

2 結(jié)果2.1 M949_RS06330 基因序列的生物信息學分析鴨疫里默氏桿菌野生株 CH3 的 M949_RS06330 基因編碼區(qū)全長 1056bp，編碼351 個氨基酸，理論分子量為 36909.58，等電點 9.41，帶正電荷的氨基酸總數(shù)為 38個，帶負電荷的氨基酸總數(shù)為 29 個。信號肽分析顯示 RS06330 編碼蛋白沒有信號肽,如圖 2-1。

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