發(fā)布時間：2020-10-01 18:53

　　 為建立可同時檢測藍舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血熱病毒(EHDV)的快速診斷方法,本研究根據(jù)BTV和EHDV保守基因序列設(shè)計特異性引物和探針,建立了雙重?zé)晒舛縍T-PCR,對該方法進行反應(yīng)條件、特異性及敏感性的驗證,并用該方法對部分已知臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示,該方法與口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反芻獸疫病毒等牛、羊常見疾病病原無交叉反應(yīng);對兩種重組質(zhì)粒標準品的檢出極限均為1×10~2copies/L;批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于2.55%。臨床試驗表明,該方法能夠快速準確地檢測出臨床組織樣品中BTV和EHDV的核酸。結(jié)果表明,本研究建立的檢測方法特異性強、敏感性高、重復(fù)性好,可以為BTV和EHDV的快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)手段。
【部分圖文】：

├磁卸ǜ梅椒ǖ鬧?復(fù)性。1.11雙重?zé)晒舛縍T-PCR的應(yīng)用收集經(jīng)過實驗室驗證的40份陽性樣品（20份BTV陽性、10份EHDV陽性、10份BTV與EHDV混合感染樣品），其他臨床組織樣品40份，共計80份，采用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR進行檢測，以驗證該方法的準確性。2結(jié)果2.1標準曲線的繪制以濃度為1×102～1×107copies/L的混合質(zhì)粒標準品作為模板，根據(jù)已優(yōu)化的條件進行雙重?zé)晒舛縍T-PCR。生成的標準曲線顯示，BTV和EHDV的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.990和0.982，表明起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見圖1）。2.2特異性試驗分別對BTV、EHDV、FMDV、VSV、SBV、PPRV、GTPV和SPPV病毒樣品提取RNA，利用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法進行檢測。結(jié)果顯示，BTV和EHDV在各自的檢測通道均有特異性擴增，而其他病毒則無明顯擴增曲線（見圖2），說明該方法具有較好的特異性。3530252015101086420拷貝數(shù)（lg）CopynumberEHDVBTV圖1雙重?zé)晒舛縍T-PCR標準曲線Fig.1Standardcurvesoftheduplexreal-timeRT-PCR圖2雙重?zé)晒舛縍T-PCR特異性試驗的擴增曲線Fig.2Dynamiccurvesoftheduplexreal-timeRT-PCRforspecificitydetection400350300250200150100500-50-100-150循環(huán)數(shù)Cyclenumber0510152025303540123-9-1.8529.68相對熒光強度Relativeluorescenceunits（RFU）熱循環(huán)數(shù)Thresholdcycle1126

，以驗證該方法的準確性。2結(jié)果2.1標準曲線的繪制以濃度為1×102～1×107copies/L的混合質(zhì)粒標準品作為模板，根據(jù)已優(yōu)化的條件進行雙重?zé)晒舛縍T-PCR。生成的標準曲線顯示，BTV和EHDV的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.990和0.982，表明起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見圖1）。2.2特異性試驗分別對BTV、EHDV、FMDV、VSV、SBV、PPRV、GTPV和SPPV病毒樣品提取RNA，利用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法進行檢測。結(jié)果顯示，BTV和EHDV在各自的檢測通道均有特異性擴增，而其他病毒則無明顯擴增曲線（見圖2），說明該方法具有較好的特異性。3530252015101086420拷貝數(shù)（lg）CopynumberEHDVBTV圖1雙重?zé)晒舛縍T-PCR標準曲線Fig.1Standardcurvesoftheduplexreal-timeRT-PCR圖2雙重?zé)晒舛縍T-PCR特異性試驗的擴增曲線Fig.2Dynamiccurvesoftheduplexreal-timeRT-PCRforspecificitydetection400350300250200150100500-50-100-150循環(huán)數(shù)Cyclenumber0510152025303540123-9-1.8529.68相對熒光強度Relativeluorescenceunits（RFU）熱循環(huán)數(shù)Thresholdcycle1126

ityassayofthedulplexreal-timeRT-PCR病毒Virus標準品濃度/（copies·L-1）組內(nèi)試驗Intra-assay組間試驗Inter-assayConcentrationofstandard平均值X±SD變異系數(shù)/％CV平均值X±SD變異系數(shù)/％CVEHDV1×10332.83±0.180.5432.78±0.391.201×10427.47±0.381.3927.79±0.301.091×10524.89±0.110.4525.48±0.321.27BTV1×10328.47±0.421.4628.18±0.401.431×10425.38±0.160.6224.94±0.642.551×10523.51±0.130.5523.10±0.562.40圖3雙重?zé)晒舛縍T-PCR敏感性試驗的擴增曲線Fig.3Dynamiccurvesoftheduplexreal-timeRT-PCRforsensitivitydetectionA：EHDV的擴增曲線；B：BTV的擴增曲線；1～6：質(zhì)粒濃度分別為1×107～1×102copies/L；7：陰性A：EHDVamplification；B：BTVamplification；1—6：Plasmidconcentrationof1×107—1×102copies/L；7：Negative2.3敏感性試驗以濃度為1×101～1×107copies/L的混合質(zhì)粒標準品作為模板，根據(jù)已優(yōu)化的條件進行雙重?zé)晒舛縍T-PCR。結(jié)果顯示，1×101copies/L未被檢測到熒光信號，其他濃度的標準品均呈陽性，說明BTV和EHDV的檢出下限均為1×102copies/L（見圖3）。2.4重復(fù)性試驗取3個濃度的混合質(zhì)粒標準品對該方法進行重復(fù)性檢驗，結(jié)果顯示，不同濃度標準品的組內(nèi)Ct值變異系數(shù)（CV）在0.54％～1.46％之間，組間Ct值CV在1.09％～2.55％之間（見表2），說明該方法具有較好的重復(fù)性。2.5臨床樣品的檢測用建立的方法對80份已知臨床樣品進行檢測，結(jié)果，40份陽性樣品的檢驗結(jié)果均為陽性：20份BTV陽性，10份EHDV陽性，10份混合感染陽性，檢出率為100％；其他40份樣品?

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