【摘要】：我國(guó)是世界養(yǎng)鵝大國(guó),鵝的存欄量和出欄量一直穩(wěn)居世界第一位。但是隨著我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的不斷發(fā)展,鵝的飼養(yǎng)密度不斷增大,發(fā)病率逐年增多,特別是小鵝瘟、禽流感、新城疫、坦布蘇病毒感染和鵝圓環(huán)病毒感染等,它們單一感染或共感染,造成鵝的發(fā)病、死亡或生產(chǎn)性能降低,給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1、建立針對(duì)鵝病毒病的快速檢測(cè)方法是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的重要前提。本研究根據(jù)H9亞型禽流感病毒(H9-AIV)的HA基因、新城疫病毒的HN基因和坦布蘇病毒的NS3基因的保守序列,設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物；采用Tizol法提取H9-AIV、NDV和TMUV的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,混合后作為PCR體系模板。在普通PCR方法的基礎(chǔ)上,通過對(duì)退火溫度、ExTaq DNA聚合酶、Buffer濃度、2.5mmol/L dNTP濃度、引物濃度比等反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化,建立同時(shí)擴(kuò)增H9-AIV (560bp)、NDV (427 bp)和TMUV (277 bp)的多重RT-PCR方法。經(jīng)特異性、敏感性及臨床驗(yàn)證性試驗(yàn),結(jié)果表明：在同一RT-PCR反應(yīng)體系中可以同時(shí)檢測(cè)到這3種病毒,而對(duì)鵝呼腸孤病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨呼腸孤病毒的檢測(cè)均為陰性；H9-AIV、NDV和TMUV的最低檢出限分別為5.8×105個(gè)拷貝、7.2x105個(gè)拷貝和4.6x105個(gè)拷貝。利用該方法對(duì)臨床陽性樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證,結(jié)果均一致。證明建立的多重RT-PCR方法可對(duì)H9-AIV、NDV和TMUV同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),具有簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn),可為鵝群這三種疾病的檢測(cè)和診斷提供快速準(zhǔn)確的方法,便于及時(shí)有效的采取防控措施,減少養(yǎng)鵝業(yè)的損失。2、為了解小鵝瘟、H9亞型禽流感、新城疫、坦布蘇病毒感染和鵝圓環(huán)病毒感染等重要鵝病毒病在我國(guó)的流行情況,本研究于2014-2015年間在我國(guó)11個(gè)主要養(yǎng)鵝省份的規(guī)�；Z場(chǎng),采集臨床上發(fā)病鵝的病料478羽份,應(yīng)用建立的針對(duì)H9-AIV、NDV和TMUV多重RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行H9-AIV、NDV和TMUV的檢測(cè)；應(yīng)用建立的針對(duì)GPV和GoCV的普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行鵝細(xì)小病毒和鵝圓環(huán)病毒的檢測(cè)；并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明478份樣品中,單一感染190份,雙重感染82份,三重感染30份,四重感染3份,陽性率分別為40%、17%、6%、1%,陰性感染173份,比例為36%; GPV、H9-AIV、NDV、TMUV和GoCV感染的陽性檢出率分別為17.1%、21.7%、18.4%、17.4%和21.7%。 GPV、H9-AIV、TMUV和GoCV等病毒的感染中混合感染比例較高,分別為55%、62%、74%和54%, NDV感染中混合感染的比例相對(duì)較低,為44%。不同季節(jié)發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)分析表明,H9和ND在春、冬季節(jié)的檢出率最高,在夏、秋季節(jié)相對(duì)較低；TMUV和GoCV在夏季檢出率較高,冬季檢出率較低,GPV在春季檢出率較高。不同日齡發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)分析表明,H9和GoCV在不同日齡段檢測(cè)的陽性率均很高,成年鵝中檢測(cè)的陽性率最高；NDV、TMUV在不同日齡段檢測(cè)的陽性率差異不顯著,但雛鵝和成年鵝感染率偏高；GPV在雛鵝時(shí)的感染率較高,育成鵝和成年鵝也普遍存在被感染的情況,但感染率較低。綜上所述,GPV、H9-AIV、NDV、TMUV和GoCV在我國(guó)大部分規(guī)�；Z場(chǎng)中普遍存在,且單一感染和共感染的現(xiàn)象均十分嚴(yán)重；混合感染中以雙重感染和三重感染為主,其中免疫抑制病病原體之間的共感染率較高,是造成我國(guó)規(guī)�；Z場(chǎng)疫病防控復(fù)雜化的主要原因之一。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.33
【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鵝群中主要的病毒病
        1.1.1 鵝細(xì)小病毒病
            1.1.1.1 病原學(xué)
            1.1.1.2 流行病學(xué)
        1.1.2 禽流感
            1.1.2.1 病原學(xué)
            1.1.2.2 流行病學(xué)
        1.1.3 新城疫
            1.1.3.1 病原學(xué)
            1.1.3.2 流行病學(xué)
        1.1.4 坦布蘇病毒病
            1.1.4.1 病原學(xué)
            1.1.4.2 流行病學(xué)
        1.1.5 鵝圓環(huán)病毒病
            1.1.5.1 病原學(xué)
            1.1.5.2 流行病學(xué)
    1.2 鵝群中主要的病毒病共感染的現(xiàn)狀
    1.3 多重PCR檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.3.1 PCR技術(shù)的概述
        1.3.2 多重PCR原理
        1.3.3 引物
        1.3.4 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化
        1.3.5 多重PCR在病原檢測(cè)中的應(yīng)用
    1.4 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒毒株
        2.1.2 主要試劑
    2.2 方法
        2.2.1 H9、NDV和TMUV三重RT-PCR檢測(cè)方法的建立
            2.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
            2.2.1.2 病毒的增殖
            2.2.1.3 病毒RNA的提取
            2.2.1.4 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄
            2.2.1.5 病毒DNA提取
            2.2.1.6 普通PCR方法的建立
            2.2.1.7 多重PCR體系條件優(yōu)化
            2.2.1.8 多重PCR的特異性和敏感性試驗(yàn)
            2.2.1.9 臨床驗(yàn)證試驗(yàn)
        2.2.2 五種重要鵝病毒病的流行病學(xué)調(diào)查
            2.2.2.1 病料采集
            2.2.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
            2.2.2.3 病毒DNA提取
            2.2.2.4 病毒RNA的提取及cDNA的制備
            2.2.2.5 病毒PCR擴(kuò)增
3 結(jié)果與分析
    3.1 H9、NDV和TMUV三重RT-PCR檢測(cè)方法建立結(jié)果
        3.1.1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.1.2 多重PCR條件的優(yōu)化結(jié)果
        3.1.3 多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果
        3.1.4 多重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果
        3.1.5 多重PCR臨床應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果
    3.2 五種重要鵝病毒病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果
        3.2.1 PCR和RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2.2 不同地區(qū)五種鵝病毒病檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
        3.2.3 五種重要病毒病單一感染和混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果
        3.2.4 五種病毒混合感染情況具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果
            3.2.4.1 GPV感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果
            3.2.4.2 H9感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果
            3.2.4.3 NDV感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果
            3.2.4.4 TMUV感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果
            3.2.4.5 GoCV感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果
        3.2.5 不同季節(jié)鵝病毒性疫病檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
        3.2.6 不同日齡段鵝病毒性疫病檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況

【參考文獻(xiàn)】

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