網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染導(dǎo)致的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病(Reticuloendotheliosis,RE)是家禽業(yè)三大病毒腫瘤疾病之一,我國肉雞的REV感染率已達(dá)20%-30%,迄今為止尚無有效的防治措施,主要原因是對REV感染的致病和免疫調(diào)控機(jī)理缺乏深入研究。目前,對REV感染脾臟組織和成纖維細(xì)胞開展了一定的探索,但淋巴細(xì)胞這一主要免疫細(xì)胞在雞感染REV過程中的免疫調(diào)控機(jī)理尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過制備雞活體和體外淋巴細(xì)胞REV感染模型,從REV感染后淋巴細(xì)胞中差異基因表達(dá)、信號通路介導(dǎo)、關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控等方面展開系列研究,以期闡明雞感染REV后淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)理及其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為我國雞群網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病防治和抗病育種等工作提供理論依據(jù)和發(fā)展思路,促進(jìn)肉雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展和提高經(jīng)濟(jì)效益。本文主要研究結(jié)果如下:1.雞REV感染模型的建立雞活體和外周血淋巴細(xì)胞的REV感染模型是本實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ),其有效性是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在。分別選擇200只1日齡的無母源抗體的SPF雞和外周血淋巴細(xì)胞用于建立REV感染模型。REV體內(nèi)感染1周或體外感染36 h后,體內(nèi)、外淋巴細(xì)胞中均檢測到較高水平的REV基因組長末端重復(fù)序列LTR表達(dá),而對照組中均未擴(kuò)增到LTR。雞活體感染REV后第1-5周的肝臟和脾臟解剖病變表明,病毒接種后第2-4周,感染組的肝臟和脾臟較之對照組明顯腫大,具備了 REV感染的病理學(xué)特征;脾臟免疫指數(shù)隨著發(fā)育先升高后降低,而胸腺和法氏囊免疫指數(shù)隨著發(fā)育逐漸降低。相比對照組,REV感染組從第2周和第3周脾臟免疫指數(shù)顯著升高,胸腺和法氏囊免疫指數(shù)均明顯降低(P0.05或P0.01);雞活體REV感染第2周與體外淋巴細(xì)胞REV感染60 h后進(jìn)行MTT檢測,體內(nèi)、外REV感染組的淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對照組(P0.05或P0.01),IL-8和IL-18表達(dá)水平在體內(nèi)、外感染組中均顯著低于對照組(P0.05或P0.01);而IFN-γ、TNFα和IL-2水平則無顯著差異。以上結(jié)果表明體內(nèi)、外REV感染模型建立成功。同時,選擇體內(nèi)REV感染后第2周的樣本用于后繼驗(yàn)證試驗(yàn)。2.雞外周血淋巴細(xì)胞體外感染REV后的免疫調(diào)控機(jī)理分析為了排除體內(nèi)REV感染的諸多干擾因素,本章試驗(yàn)基于已經(jīng)建立的體外REV感染淋巴細(xì)胞模型,利用RNA-seq技術(shù),從REV感染后基因表達(dá)改變、信號通路介導(dǎo)等角度深入系統(tǒng)地解析REV感染后淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)理。以|log2(Fold change)|≥2.0,padj0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),RNA-seq共篩選到2977個差異表達(dá)基因(Differential expression genes,DEGs),包括996個上調(diào)基因和1981個下調(diào)基因;基于2977個DEGs的聚類分析顯示,REV感染組和對照組完全被分開,且組內(nèi)3個重復(fù)被聚集在一起。qRT-PCR驗(yàn)證部分DEGs結(jié)果表明:RNA-seq和qRT-PCR兩種方法得到的結(jié)果具有一致性,具有高度的正相關(guān)性(r=0.9014,P0.01),支持了 RNA-seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。GO 聚類分析發(fā)現(xiàn) Inflammatory response、Defence response to bacterium 和 Cell proliferation等被顯著富集,KEGGPathway分析發(fā)現(xiàn)MAPK-AP1、免疫應(yīng)答相關(guān)通路(Toll-likereceptor,NOD-likereceptor 和 salmonellainfection)、細(xì)胞增殖/凋亡相關(guān)通路(FOXO 和p53)等信號通路被顯著富集。根據(jù)顯著富集的GO-terms和KEGG pathway,篩選到與免疫相關(guān)的DEGs 130個、與細(xì)胞周期相關(guān)的DEGs 56個、與脂肪代謝相關(guān)的DEGs 55個。其中,富集于免疫相關(guān)信號通路的IL8L1、IL18、TRR2A、TLR4、TLR7、TRAF3、TRAFF5和TRAF6等基因在REV感染淋巴細(xì)胞后表達(dá)量顯著下調(diào),而CD40、CD80、NOD1和MYD88基因則顯著上調(diào),推斷這些基因可能是REV體外感染淋巴細(xì)胞后調(diào)控免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因;發(fā)現(xiàn) Toll-like receptor、NOD-like receptor 和 salmonella infection 三條信號通路同時匯集于MAPK-AP1通路,進(jìn)而下調(diào)免疫因子IL-8和IL-18的表達(dá)水平。細(xì)胞增殖相關(guān)CCNB2、CCNB3、CCND1、CCND2、CCND3、CCNG2、CDKN1B、GADD45A等DEGs顯著富集于FOXO信號通路,而GADD45A、CCNB2、CCNB3、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2和CDK6等顯著富集在p53信號通路中。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,SMAD3、FOXO1、FOX03、FOXO4、CCND1、CCND2、CCNE2、CDKN1B等基因的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P0.05)。然而,TGFB、TGFBR2、IL10、CCNG1、GADD45A、CCNA2、CCNB2、CCND3和的表達(dá)水平卻顯著上調(diào)(P0.05);推斷上述基因可能是REV體外感染淋巴細(xì)胞后調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵候選基因。REV感染雞外周血淋巴細(xì)胞后,通過抑制FOXO和p53信號通路來下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá),從而抑制淋巴細(xì)胞的增殖。此外,還篩選到了 55個與脂肪代謝相關(guān)的DEGs。其中,脂肪酸代謝與脂肪合成相關(guān)的基因ACSL3、ACSL6、DGAT2等在REV感染淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于對照組細(xì)胞(P0.01),而脂肪分解和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因PPARG、FABP3、FABP4、LPL、PLIN2的表達(dá)量則顯著高于對照組細(xì)胞(P0.01),提示了 REV感染后,雞淋巴細(xì)胞利用外源脂肪酸的能力增強(qiáng),提示可能外源脂肪酸是REV感染致病或免疫調(diào)控過程的主要能量來源。3.MAPK-AP1通路介導(dǎo)雞免疫應(yīng)答REV感染作用的驗(yàn)證根據(jù)第二章體外淋巴細(xì)胞REV感染模型的結(jié)果,在活體和細(xì)胞水平驗(yàn)證了 MAPK-AP1在REV感染外周血淋巴細(xì)胞中的作用。首先,檢測了體內(nèi)、外REV感染模型中AP-1水平以及ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化活性變化,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)、外模型淋巴細(xì)胞中AP-1水平、JNK和p38MAPK的磷酸化活性均明顯降低,而ERK1/2的磷酸化水平無明顯變化,提示JNK和p38MAPK信號通路均通過AP1蛋白參與了 REV感染后外周血淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)控。進(jìn)一步地,單獨(dú)抑制淋巴細(xì)胞中JNK或p38MAPK的磷酸化活性后,AP1蛋白水平均明顯下調(diào),淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯減少,并且免疫因子IL-8和IL-18分泌水平顯著地降低;相反地,單獨(dú)激活REV體外感染的淋巴細(xì)胞中JNK或p38MAPK的磷酸化活性,AP1蛋白水平均明顯上調(diào),淋巴細(xì)胞的數(shù)目和免疫因子IL-8、IL-18的分泌水平顯著地升高;JNK和p38MAPK被同時抑制或激活后,淋巴細(xì)胞的數(shù)目和免疫因子IL-8和IL-18的分泌水平均顯著高于單獨(dú)處理組。此外,正常外周血淋巴細(xì)胞中AP1蛋白水平被特異性抑制劑處理后,淋巴細(xì)胞的數(shù)目和免疫因子IL-8、IL-18的分泌水平亦會顯著地降低。以上證實(shí)了JNK/p38MAPK-AP1信號通路通過調(diào)控淋巴細(xì)胞的增殖和免疫因子IL-8和IL-18的分泌,參與REV感染后雞外周血淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答調(diào)控過程。最后,體外抑制AP1活性之后的細(xì)胞數(shù)目和免疫因子(IL-8和IL-18)分泌水平具有顯著的正向相關(guān)性,提示了 REV感染外周血淋巴細(xì)胞中免疫因子(IL-8和IL-18)分泌的降低與胞內(nèi)相關(guān)基因活性和淋巴細(xì)胞數(shù)目減少相關(guān)。4.LncRNA對淋巴細(xì)胞應(yīng)答REV感染的關(guān)鍵基因及其通路的表達(dá)調(diào)控LncRNA作為miRNA、piRNA、內(nèi)源性siRNA等小分子RNA的前體分子,可以通過表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方式改變靶基因的表達(dá)。因此,本章探究了LncRNA對所篩選的關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)控作用,進(jìn)一步完善REV感染雞外周血淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)理。基于RNA-seq數(shù)據(jù),篩選到134個差異表達(dá)LncRNA。綜合顯著富集的免疫相關(guān)信號通路和差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行LncRNA靶基因預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)有2個新的LncRNAs(L11530和L09863)可能分別調(diào)控NOD-like receptor信號通路中NOD1和TRAF5基因表達(dá)�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,這2個候選LncRNAs通過順式調(diào)控的方式調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,REV體外感染外周血淋巴細(xì)胞中L11530及其靶基因NOD1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05,P0.01),而L09863及其靶基因TRAF5表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05,P0.01);相同的表達(dá)變化規(guī)律也發(fā)生在體內(nèi)REV感染雞的外周血淋巴細(xì)胞中。相反地,L11530被干擾后則相應(yīng)的靶基因表達(dá)具有相反的變化。以上結(jié)果提示了新篩選到的LncRNAs(L11530和L09863)可能分別通過靶向調(diào)控雞外周血淋巴細(xì)胞中NOD1或TRAF5的表達(dá)而參與REV感染雞的免疫調(diào)控。綜合上述內(nèi)容,本研究從REV感染后基因表達(dá)改變、信號通路介導(dǎo)和關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控等角度解析了 REV感染后的雞外周血淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子調(diào)控機(jī)理。發(fā)現(xiàn)REV感染雞后,外周血淋巴細(xì)胞通過抑制FOXO和p53信號通路而減少細(xì)胞增殖,同時通過抑制MAPK(JNK/p38MAPK)-AP1信號通路減少免疫因子IL-8和IL-18分泌,達(dá)到免疫調(diào)控的效應(yīng)。另外,發(fā)現(xiàn)REV感染雞外周血淋巴細(xì)胞后胞內(nèi)外源脂肪代謝活動旺盛,可能在REV感染致病和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。在此免疫調(diào)控過程中,表達(dá)下調(diào)基因IL8L1、IL18、TLR2A、TLR4、TLR7、TRAF3、TRAF5、TRAF6和上調(diào)基因CD40、CD80、NOD1、MYD88等是REV感染后淋巴細(xì)胞中免疫調(diào)控的關(guān)鍵基因,LncRNA通過靶向調(diào)控NOD和TRAF5的表達(dá)而參與REV感染雞的免疫調(diào)控;此外,下調(diào)表達(dá)基因SMAD3、FOXO1、FOXO3、FOXO4、CCND1、CCND2、CCNE2、CDKN1B 等和上調(diào)表達(dá)基 因 TGFB、TGFBR2、IL10、CCNG1、GADD45A、CCNA2、CCNB2、CCND3、CDK6等則是調(diào)控淋巴細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因。以上述結(jié)果為基礎(chǔ)構(gòu)建了REV感染的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為揭示雞外周血淋巴細(xì)胞對REV免疫應(yīng)答的潛在分子機(jī)理提供新的線索。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

生存過程中的長期環(huán)境壓力進(jìn)化出了抵御外界大多數(shù)病菌危害的疫系統(tǒng)包括免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子。其中，中樞免疫器腺，而外周免疫器官則包括脾臟、盲腸和扁桃體等（見圖Ｍ邋）。對腺和脾臟三者在體液免疫及細(xì)胞免疫中起著舉足輕重的作用。逡逑

３．１雞體內(nèi)、外ＲＥＶ感染模型的建立逡逑在ＲＥＶ感染肉雞１周后，采集外周血以分離淋巴細(xì)胞，并提�。模危粒涣硗�，在ＲＥＶ逡逑體外感染淋巴細(xì)胞３６邋ｈ后，收集培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞并提�。模危痢Ｍㄟ^ＰＣＲ檢測，如圖２－１逡逑所發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的特異性ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１．５％瓊脂糖凝膠電泳，其片段大小符合預(yù)期；擴(kuò)增產(chǎn)逡逑物測序結(jié)果確認(rèn)為雞的ＬＴＲ目標(biāo)片段。逡逑經(jīng)過ＲＥＶ感染后的雞外周血淋巴細(xì)胞中ＲＥＶ（ＧｅｎＢａｎｋＳ７０３９８）長末端重復(fù)序列ＬＴＲ逡逑的目標(biāo)片段ＬＴＲ被擴(kuò)增到，并且具有較高的水平；體外感染的淋巴細(xì)胞中，同樣，ＲＥＶ逡逑（ＧｅｎＢａｎｋ邋Ｓ７０３９８）長末端重復(fù)序列ＬＴＲ的目標(biāo)片段ＬＴＲ被擴(kuò)X椀劍簿哂薪細(xì)叩乃�。辶x系牽歉髯緣畝哉兆櫓芯蠢┰齙劍蹋裕搖ｅ義霞釤甯腥荊遙牛趾螅詰冢薄ⅲ�、觫５A(chǔ)ⅲ抵芊直鶩澇祝始烊「臥嗪推⒃�，观察其形辶x咸浠＝峁礱鰨遙牛指腥咀楹投哉兆櫚母臥嗪推⒃嘧櫓孀湃樟淶腦黽傭⒂浯�。辶x系牽癰腥競蟮冢玻粗埽現(xiàn)錘腥荊遙牛值畝哉兆�，感染讬澳概P嗪推⒃囁濟(jì)饗災(zāi)族義洗

本文編號：2829993