豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是目前中國國內(nèi)乃至全球范圍養(yǎng)豬業(yè)中一種較為嚴重的病毒性傳染性疾病,主要以引起母豬的繁殖障礙癥狀和仔豬的呼吸道疾病為特征。該疾病是由藍耳病毒(PRRSV)引起,于1987年首次在北美被發(fā)現(xiàn),隨后便在世界范圍內(nèi)迅速而廣泛傳播,給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為巨大的的經(jīng)濟損失。然而目前該病并沒有行之有效的科學(xué)的治療手段,主要以預(yù)防為主。宿主細胞的抗PRRSV機制的研究能夠為PRRS的防控及新型疫苗的研發(fā)提供新的思路和方法。本實驗室成員已做的蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)研究結(jié)果表明,豬外周血單核樹突狀細胞(MoDCs)感染高致病性PRRSV后,在較長一段時間內(nèi),豬Mx1蛋白的表達顯著上調(diào)。那么Mx1蛋白是否具有抗PRRSV的功能?其機制又是什么?為此,我主要進行了以下幾個方面的研究:1、豬Mx1蛋白的抗PRRS病毒活性我構(gòu)建了Mx1蛋白及其分段蛋白的質(zhì)粒,通過TCID_(50)試驗,我證明了豬Mx1蛋白可以大大降低PRRSV的滴度,表明Mx1蛋白具有顯著的抑制PRRSV增殖的活性,其中,Mx1蛋白的G結(jié)構(gòu)域發(fā)揮了主要的抗病毒作用。絕對熒光定量試驗結(jié)果進一步證明,Mx1蛋白可以顯著降低PRRSV gRNA水平,其中,G結(jié)構(gòu)域發(fā)揮了主要作用。2、Mx1蛋白的G結(jié)構(gòu)域與PRRSV的核衣殼蛋白N的C末端結(jié)構(gòu)域互作為了探究Mx1蛋白與PRRSV的蛋白的相互關(guān)系,我構(gòu)建了PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的表達載體。通過Renilla Luciferase Assay(RLA)試驗,成功篩選到了與Mx1互作的N蛋白,同時也篩選到與N蛋白互作的是Mx1蛋白的G結(jié)構(gòu)域。隨后我通過免疫共沉淀試驗(Co-IP)輔助證明了這些結(jié)果。將N蛋白進一步分段后,Co-IP證明了G結(jié)構(gòu)域與N蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域(NC)互作。3、Mx1蛋白的G結(jié)構(gòu)域與N蛋白C末端結(jié)構(gòu)域共定位于細胞質(zhì)我將Mx1、Mx1突變體、G結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒分別與PRRSV N蛋白、N蛋白N端(NN)、N蛋白C端(NC)、N蛋白NLS突變體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,通過間接免疫熒光試驗(IFA)證明,Mx1與N蛋白、G蛋白與NC蛋白可以共定位于細胞質(zhì),表明Mx1蛋白可能主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮抗病毒作用。綜上所述,本研究首次初步揭示了豬Mx1蛋白抑制PRRSV增殖的分子機制,即豬Mx1蛋白在細胞質(zhì)中通過G結(jié)構(gòu)域與N蛋白的C端結(jié)構(gòu)域互作,綁定到病毒衣殼蛋白N上,進而抑制了PRRSV的增殖,降低病毒滴度。本研究結(jié)果擴充了Mx1蛋白抗病毒分子機制的多樣性,并為預(yù)防和控制PRRSV感染提供了新的思路和方法。
【學(xué)位單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

圖1.2 PRRSV N蛋白的一級結(jié)構(gòu)域[61]蛋白是PRRSV感染的細胞中含量最豐富的病毒蛋白，約占病毒粒子蛋白它在豬體內(nèi)具有高度的免疫原性，而且被認為是具有多功能性[63]。PRRSV毒衣殼的唯一結(jié)構(gòu)蛋白成分，通過共價和非共價相互作用與自身結(jié)合，為裝提供了基礎(chǔ)，共價鍵連接的N-N同二聚體通過位于23位的半胱氨酸殘基質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基復(fù)合體的管腔內(nèi)形成[64]。PRRSV的整個生命周期發(fā)生細胞質(zhì)中，因此PRRSVN蛋白主要存在于細胞質(zhì)和核周區(qū)域。由于具有核RRSVN蛋白也存在于感染細胞的細胞核和核仁中[65]。北美基因型PRRSVN位(10-KRKK)和41-47位(41-PGKKN/SKK)含有兩個假定的NLS基序，這些似于Fpat4-和Fpat7-NLS。先前使用PRRSV SDSU-23983分離物的研究工作-NLS對N的核定位是充分必要的。PRRSVN蛋白的功能核定位信號(NLS)已位的堿性氨基酸(PGKKNKK)中被識別，并已被證明與核轉(zhuǎn)運蛋白import-a[66]。因此，研究人員認為N蛋白可以經(jīng)由核定位信號依賴性的輸入蛋白α和運途徑實現(xiàn)入核。由于PRRSV的裝配和成熟發(fā)生在ER和高爾基區(qū)，因此

圖 1.3 Mx 蛋白的一級結(jié)構(gòu)域[78]1.3.2 Mx 蛋白的抗病毒功能Mx 基因隨后在其他脊椎動物中被鑒定出來，通常有一到三個亞型。這些 Mx 蛋白中的許多，包括人類同源蛋白 MxA，對多種 RNA 病毒和一些 DNA 病毒具有抗病毒活性[79]。許多 Mx 蛋白，包括人類同源蛋白 MxA，對諸多 RNA 病毒和一些 DNA 病毒具有顯著的抗病毒活性[80]。這種活性據(jù)推測隨蛋白質(zhì)的亞細胞定位的不同而改變。細胞核形式(如小鼠 Mx1)可防止病毒在細胞核內(nèi)復(fù)制，如流感病毒和托高土病毒[81]，而細胞質(zhì)形式(如小鼠 Mx2)可抑制水泡性口炎病毒(VSV)和其他一些病毒在細胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制[82]。人類的 MxA 蛋白定位在細胞質(zhì)中，但無論在何種情況下都具有廣泛的抗病毒譜病毒的亞細胞復(fù)制位點[83]。1.3.3 豬 Mx1 蛋白的抗病毒功能目前總共有兩種 Mx 基因已在豬中被報道，并被分別命名為 Mx1 和 Mx2[84]。全長的豬 Mx1(poMx1)基因(1,992 bp)首次從德國長白豬 Landrace 品種中分離出來，并定[85]

第 2 章 豬 Mx1 蛋白抗 PRRSV 活性的功能研究.2 試驗方法.2.1 Mx1 及分段基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定(1) 引物設(shè)計與合成根據(jù)豬 Mx1 基因序列（GenBank 登錄號：AB164037）將 Mx1 基因分為如下部分：SE1，1-201 bp；G domain，202-1023 bp；BSE2，1024-1101 bp；MD+Loop4，1102-728 bp；GED，1729-1983 bp。對 Mx1 基因結(jié)構(gòu)劃分如圖 2.1 所示。分別將 Mx1 全長，BSE1+G domain（G），G domain+BSE2+MD（GMD），SE2+MD+Loop4（MDL4）以及 GED 片段進行了擴增，利用 Primer premier 5 軟件各計一對含 Not I，Hind III 酶切位點的特異引物，上游引物添加 Flag 標簽序列，引物列見表 2.1。

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