隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,由堿基序列組成的生命畫卷逐漸呈現(xiàn)在世人面前。基于日漸完善的基因組序列信息,特定基因的功能研究、遺傳疾病的堿基突變檢測(cè)及畜禽優(yōu)良性狀的基因定位和改良等系列研究也逐步推進(jìn)。以上研究主要通過(guò)基因組編輯技術(shù)對(duì)靶基因序列實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)插入、序列刪除或堿基突變實(shí)現(xiàn)�；蚪M編輯技術(shù)依賴人工特異性核酸酶在基因組上制造雙鏈斷裂及由此引發(fā)的DNA修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)基因編輯�，F(xiàn)階段兩種主要的DNA修復(fù)途徑導(dǎo)致的編輯結(jié)果分為:通過(guò)非同源末端鏈接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)修復(fù)途徑產(chǎn)生堿基插入或缺失造成基因敲除,和通過(guò)帶有斷口兩端同源序列的供體DNA參與的同源介導(dǎo)的修復(fù)(Homology-directed repair,HDR)途徑實(shí)現(xiàn)特定堿基序列的插入、刪除或替換。在疾病治療和畜禽性狀改良的實(shí)際應(yīng)用中,要求在對(duì)基因組序列進(jìn)行改造的過(guò)程中保證基因組編輯的精確性,即除了目的堿基的刪除、插入或替換外,不引入任何額外的堿基序列,這一技術(shù)被稱為基因組精確編輯。目前存在的基因組精確編輯技術(shù)根據(jù)基因組編輯次數(shù)劃分,可以分為一步法和兩步法。一步法使用核酸酶在基因組上造成雙鏈斷裂之后,以環(huán)狀質(zhì)粒、雙鏈DNA或者單鏈DNA為模板,通過(guò)HDR直接向基因組中引入點(diǎn)突變、堿基缺失或序列插入。兩步法在第一步通過(guò)HDR引入點(diǎn)突變、堿基缺失或序列插入的同時(shí),引入用于陽(yáng)性篩選的整合序列;第二步通過(guò)Cre-Loxp、piggyBac或二次HDR的方式,將第一步引入的篩選序列刪除,最終得到基因組精確編輯結(jié)果。一步法的修復(fù)結(jié)果只能通過(guò)測(cè)序?qū)庉嬛蟮募?xì)胞單克隆進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè),耗時(shí)耗力且效率低,因此一般通過(guò)藥物或者熒光篩選系統(tǒng),幫助得到核酸酶轉(zhuǎn)染陽(yáng)性或者核酸酶打靶陽(yáng)性的克隆,此方法一般用于胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或者原核注射等試驗(yàn)。而在現(xiàn)存的兩步法技術(shù)中,Cre-Loxp系統(tǒng)敲出篩選序列之后會(huì)在基因組上殘留一個(gè)Loxp序列,可能導(dǎo)致基因沉默、染色體結(jié)構(gòu)改變等隱患;piggyBac轉(zhuǎn)座子在實(shí)現(xiàn)序列高效刪除的同時(shí),可能會(huì)引起基因組其他TTAA位點(diǎn)處篩選序列隨機(jī)插入;二次HDR的方法則面臨因整合至基因組的篩選基因沉默而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。本研究提供了一種新的兩步法基因組精確編輯技術(shù)——基于單鏈退火(Single strand annealing,SSA)修復(fù)機(jī)制的基因組精確編輯技術(shù)。該策略的供體DNA包含正、負(fù)藥物及熒光篩選基因的篩選表達(dá)盒序列,和序列兩側(cè)同向同源的SSA同源臂序列。該技術(shù)第一步依賴CRISPR/Cas9產(chǎn)生雙鏈斷裂,經(jīng)由帶有點(diǎn)突變的同源臂介導(dǎo)的HDR,向基因組中帶入精確編輯序列的同時(shí),插入篩選表達(dá)盒及SSA同源臂序列;第二步靶向篩選表達(dá)盒外側(cè)、SSA同源臂內(nèi)側(cè)的靶位點(diǎn),造成兩個(gè)雙鏈斷裂,在刪除篩選序列同時(shí)引發(fā)SSA修復(fù)機(jī)制,完成基因組精確編輯�；谝陨侠碚撛O(shè)計(jì),本研究主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建了單鏈退火(SSA)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù),并利用該系統(tǒng)在293T細(xì)胞的CCR5位點(diǎn)、APP位點(diǎn)和α-syn位點(diǎn)分別獲得45.83%,68%和50%的精確編輯效率。2.針對(duì)基因組編輯系統(tǒng)的第一步HDR供體載體形式和第二步SSA同源臂長(zhǎng)度兩個(gè)方面,對(duì)試驗(yàn)一獲得系統(tǒng)的效率進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)雙切質(zhì)粒供體具有更高的整合效率,且基因組上的SSA效率與同源臂長(zhǎng)度呈正相關(guān)。3.基于試驗(yàn)二優(yōu)化結(jié)果對(duì)供體載體進(jìn)行改良,并利用改良載體在PK15細(xì)胞的IGF2位點(diǎn)和RELA位點(diǎn)進(jìn)行應(yīng)用,分別獲得30%和53.33%的精確編輯效率。4.由于在基于單鏈退火的基因組精確編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)中(試驗(yàn)一、二、三),沒(méi)有觀察到雙等位編輯的結(jié)果;但在遺傳疾病治療、基因功能研究及畜禽品種改良中,雙等位基因編輯具有重要應(yīng)用價(jià)值。故基于試驗(yàn)一、二、三中使用的正負(fù)篩選表達(dá)盒序列設(shè)計(jì)原則,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出了用于雙等位基因編輯的TK-Puro~R-eGFP/TK-Zeo~R-mRFP雙等位基因敲入系統(tǒng),且在293T細(xì)胞的APP位點(diǎn)和PSEN1位點(diǎn)分別得到52.94%和54.90%的雙等位編輯效率。在TK-Puro~R-eGFP/Tk-Zeo~R-mRFP雙等位編輯系統(tǒng)基礎(chǔ)之上優(yōu)化篩選表達(dá)盒長(zhǎng)度,構(gòu)建了Puro~R-eGFP-TK/Zeo~R-mRFP-TK和Puro~R-TK/Zeo~R-TK兩套效率更高的雙等位敲入系統(tǒng),在APP位點(diǎn)得到了更為高效的雙等位基因編輯效率,敲入效率分別為82%和70%。本研究開(kāi)發(fā)了一套簡(jiǎn)潔高效,具有普遍適應(yīng)性的單鏈退火(SSA)介導(dǎo)的基因組精確編輯系統(tǒng),為基因功能研究、遺傳疾病治療和家畜生產(chǎn)性狀改良提供了新的方案。基于此開(kāi)發(fā)的三套高效的雙等位編輯系統(tǒng)為雙等位基因操作提供了新的思路,并為后續(xù)雙等位基因精確編輯奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S813
【部分圖文】：

報(bào)告篩選一體化載體根據(jù)其修復(fù)原理可進(jìn)一步分為，基于 NHEJ 修復(fù)原理、SSA修復(fù)原理或 HDR 修復(fù)原理的篩選報(bào)告一體化載體。本實(shí)驗(yàn)室受信號(hào)燈報(bào)告系統(tǒng)（TrafficLight Reporter, TLR）啟發(fā)(Kuhar et al. 2014)，開(kāi)發(fā)出了分別基于 NHEJ 和 SSA 修復(fù)原理的兩套R(shí)PG(DsRed-PuroR-eGFP)報(bào)告篩選系統(tǒng)(Ren et al. 2015)。在兩套 RPG 系統(tǒng)中，用自帶啟動(dòng)子和終止序列的 DsRed 基因表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，利用被基因組靶位點(diǎn)序列打斷的嘌呤霉素抗性基因和通過(guò) T2A 剪切肽串聯(lián)的綠色熒光蛋白來(lái)檢測(cè)核酸酶效率和富集細(xì)胞。若嘌呤霉素抗性基因開(kāi)放閱讀框在核酸酶打靶之后發(fā)生修復(fù)，藥物篩選基因與熒光基因則可得以順利表達(dá)，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)藥物篩選或者流式分選得到打靶陽(yáng)性細(xì)胞，即可用于計(jì)算核酸酶打靶效率。NHEJ-RPG 報(bào)告系統(tǒng)的閱讀框修復(fù)是通過(guò) NHEJ方式進(jìn)行，因?yàn)殚喿x框有三種情況的移碼修復(fù)，最終只有三分之一的修復(fù)情況能夠?qū)崿F(xiàn)抗性基因和熒光基因的順利表達(dá)（圖 1-2(a)）。SSA-RPG 報(bào)告系統(tǒng)在修復(fù)時(shí)，會(huì)通過(guò) SSA 刪掉斷裂口兩端其中一段重復(fù)序列，從而實(shí)現(xiàn)閱讀框修復(fù)（圖 1-2(b)）。其他研究中類似的篩選系統(tǒng)也同樣是采用一個(gè)完整的熒光基因表達(dá)盒來(lái)顯示轉(zhuǎn)染效率，后單獨(dú)或同時(shí)采用修復(fù)之后的熒光基因或藥物抗性基因來(lái)篩選核酸酶工作陽(yáng)性的細(xì)胞。

1.2.2 篩選基因的基因組整合表達(dá)篩選基因的基因組整合表達(dá)又可以分為預(yù)先整合篩選基因至基因組的報(bào)告細(xì)胞系和隨供體整合兩種形式。整合篩選基因的報(bào)告細(xì)胞系多用于研究雙鏈斷裂的修復(fù)機(jī)制、比較不同供體設(shè)計(jì)的效率高低或優(yōu)化核酸酶等。在這類整合細(xì)胞系中，使用較為廣泛的是采用信號(hào)燈報(bào)告系統(tǒng)（Traffic Light Reporter, TLR）(Certo et al. 2011)制作的整合細(xì)胞系(Davis et al.2011)。該細(xì)胞系可通過(guò)不同的修復(fù)方式產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，以研究雙鏈斷裂之后的HDR 和 NHEJ 兩種修復(fù)機(jī)制各自的修復(fù)效率。TLR 報(bào)告系統(tǒng)可以通過(guò)慢病毒載體或者直接將報(bào)告系統(tǒng)載體線性化之后電轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行構(gòu)建，后經(jīng)過(guò)熒光或者藥物篩選得到(Kuhar et al. 2014)。例如：Chu 等人將 TLR 報(bào)告系統(tǒng)整合至基因組的 AAVS1 位點(diǎn)得到單等位整合的 AAVS1TLR/+和雙等位整合的 AAVS1TLR/TLR兩種報(bào)告細(xì)胞系(Chu et al.2015)，Lin 等將其用于研究融合 RecA 的 Cas9 蛋白的基因敲除效率(Lin et al. 2017)，之圖 1-3 (a) 共打靶篩選工作原理圖；(b) HDR-USR1 載體工作原理圖Fig.1-3 (a) Function principle of co-targeting with selection; (b) Function principle of HDR-USR1 vector

正后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆(Xie et al. 2014)。Ye 等人s 或者 CRISPR/Cas9 制造雙鏈斷裂，將同時(shí)具有正負(fù)篩到基因組中，隨后第二步通過(guò)轉(zhuǎn)座酶將篩選表達(dá)盒移除 et al. 2014)。但是，由于 TTAA 位點(diǎn)在基因組中廣泛機(jī)插入，因此在第二步負(fù)向篩選藥物 FIAU (1-(2-deox-5-iodouracil)的壓力作用下，會(huì)出現(xiàn)基因組中殘留篩選性的假陽(yáng)性單克隆，且試驗(yàn)結(jié)果證明，以上兩個(gè)試驗(yàn)次整合概率都在 70%以上，給基因組留下了極大的安介導(dǎo)的重組刪除辦法系統(tǒng)之外，還存在通過(guò)兩次 HDR 完成精確編輯的策略上面兩種辦法一樣，在第一次打靶時(shí)敲入篩選標(biāo)記基修復(fù)，將篩選標(biāo)記基因刪除(Xi et al. 2015)（圖 1-4）。子甲基化而導(dǎo)致的篩選基因沉默，會(huì)降低第二步單。

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