隨著測序技術的不斷發(fā)展,由堿基序列組成的生命畫卷逐漸呈現(xiàn)在世人面前�；谌諠u完善的基因組序列信息,特定基因的功能研究、遺傳疾病的堿基突變檢測及畜禽優(yōu)良性狀的基因定位和改良等系列研究也逐步推進。以上研究主要通過基因組編輯技術對靶基因序列實現(xiàn)定點插入、序列刪除或堿基突變實現(xiàn)�；蚪M編輯技術依賴人工特異性核酸酶在基因組上制造雙鏈斷裂及由此引發(fā)的DNA修復途徑實現(xiàn)基因編輯。現(xiàn)階段兩種主要的DNA修復途徑導致的編輯結果分為:通過非同源末端鏈接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)修復途徑產生堿基插入或缺失造成基因敲除,和通過帶有斷口兩端同源序列的供體DNA參與的同源介導的修復(Homology-directed repair,HDR)途徑實現(xiàn)特定堿基序列的插入、刪除或替換。在疾病治療和畜禽性狀改良的實際應用中,要求在對基因組序列進行改造的過程中保證基因組編輯的精確性,即除了目的堿基的刪除、插入或替換外,不引入任何額外的堿基序列,這一技術被稱為基因組精確編輯。目前存在的基因組精確編輯技術根據(jù)基因組編輯次數(shù)劃分,可以分為一步法和兩步法。一步法使用核酸酶在基因組上造成雙鏈斷裂之后,以環(huán)狀質粒、雙鏈DNA或者單鏈DNA為模板,通過HDR直接向基因組中引入點突變、堿基缺失或序列插入。兩步法在第一步通過HDR引入點突變、堿基缺失或序列插入的同時,引入用于陽性篩選的整合序列;第二步通過Cre-Loxp、piggyBac或二次HDR的方式,將第一步引入的篩選序列刪除,最終得到基因組精確編輯結果。一步法的修復結果只能通過測序對編輯之后的細胞單克隆進行逐個檢測,耗時耗力且效率低,因此一般通過藥物或者熒光篩選系統(tǒng),幫助得到核酸酶轉染陽性或者核酸酶打靶陽性的克隆,此方法一般用于胚胎干細胞、誘導多能干細胞或者原核注射等試驗。而在現(xiàn)存的兩步法技術中,Cre-Loxp系統(tǒng)敲出篩選序列之后會在基因組上殘留一個Loxp序列,可能導致基因沉默、染色體結構改變等隱患;piggyBac轉座子在實現(xiàn)序列高效刪除的同時,可能會引起基因組其他TTAA位點處篩選序列隨機插入;二次HDR的方法則面臨因整合至基因組的篩選基因沉默而導致的假陽性結果。本研究提供了一種新的兩步法基因組精確編輯技術——基于單鏈退火(Single strand annealing,SSA)修復機制的基因組精確編輯技術。該策略的供體DNA包含正、負藥物及熒光篩選基因的篩選表達盒序列,和序列兩側同向同源的SSA同源臂序列。該技術第一步依賴CRISPR/Cas9產生雙鏈斷裂,經(jīng)由帶有點突變的同源臂介導的HDR,向基因組中帶入精確編輯序列的同時,插入篩選表達盒及SSA同源臂序列;第二步靶向篩選表達盒外側、SSA同源臂內側的靶位點,造成兩個雙鏈斷裂,在刪除篩選序列同時引發(fā)SSA修復機制,完成基因組精確編輯�；谝陨侠碚撛O計,本研究主要結果如下:1.構建了單鏈退火(SSA)介導的基因組編輯技術,并利用該系統(tǒng)在293T細胞的CCR5位點、APP位點和α-syn位點分別獲得45.83%,68%和50%的精確編輯效率。2.針對基因組編輯系統(tǒng)的第一步HDR供體載體形式和第二步SSA同源臂長度兩個方面,對試驗一獲得系統(tǒng)的效率進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)雙切質粒供體具有更高的整合效率,且基因組上的SSA效率與同源臂長度呈正相關。3.基于試驗二優(yōu)化結果對供體載體進行改良,并利用改良載體在PK15細胞的IGF2位點和RELA位點進行應用,分別獲得30%和53.33%的精確編輯效率。4.由于在基于單鏈退火的基因組精確編輯技術的開發(fā)中(試驗一、二、三),沒有觀察到雙等位編輯的結果;但在遺傳疾病治療、基因功能研究及畜禽品種改良中,雙等位基因編輯具有重要應用價值。故基于試驗一、二、三中使用的正負篩選表達盒序列設計原則,進一步開發(fā)出了用于雙等位基因編輯的TK-Puro~R-eGFP/TK-Zeo~R-mRFP雙等位基因敲入系統(tǒng),且在293T細胞的APP位點和PSEN1位點分別得到52.94%和54.90%的雙等位編輯效率。在TK-Puro~R-eGFP/Tk-Zeo~R-mRFP雙等位編輯系統(tǒng)基礎之上優(yōu)化篩選表達盒長度,構建了Puro~R-eGFP-TK/Zeo~R-mRFP-TK和Puro~R-TK/Zeo~R-TK兩套效率更高的雙等位敲入系統(tǒng),在APP位點得到了更為高效的雙等位基因編輯效率,敲入效率分別為82%和70%。本研究開發(fā)了一套簡潔高效,具有普遍適應性的單鏈退火(SSA)介導的基因組精確編輯系統(tǒng),為基因功能研究、遺傳疾病治療和家畜生產性狀改良提供了新的方案�；诖碎_發(fā)的三套高效的雙等位編輯系統(tǒng)為雙等位基因操作提供了新的思路,并為后續(xù)雙等位基因精確編輯奠定了基礎。
【學位單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S813
【部分圖文】：

報告篩選一體化載體根據(jù)其修復原理可進一步分為，基于 NHEJ 修復原理、SSA修復原理或 HDR 修復原理的篩選報告一體化載體。本實驗室受信號燈報告系統(tǒng)（TrafficLight Reporter, TLR）啟發(fā)(Kuhar et al. 2014)，開發(fā)出了分別基于 NHEJ 和 SSA 修復原理的兩套RPG(DsRed-PuroR-eGFP)報告篩選系統(tǒng)(Ren et al. 2015)。在兩套 RPG 系統(tǒng)中，用自帶啟動子和終止序列的 DsRed 基因表達檢測轉染效率，利用被基因組靶位點序列打斷的嘌呤霉素抗性基因和通過 T2A 剪切肽串聯(lián)的綠色熒光蛋白來檢測核酸酶效率和富集細胞。若嘌呤霉素抗性基因開放閱讀框在核酸酶打靶之后發(fā)生修復，藥物篩選基因與熒光基因則可得以順利表達，進一步經(jīng)過藥物篩選或者流式分選得到打靶陽性細胞，即可用于計算核酸酶打靶效率。NHEJ-RPG 報告系統(tǒng)的閱讀框修復是通過 NHEJ方式進行，因為閱讀框有三種情況的移碼修復，最終只有三分之一的修復情況能夠實現(xiàn)抗性基因和熒光基因的順利表達（圖 1-2(a)）。SSA-RPG 報告系統(tǒng)在修復時，會通過 SSA 刪掉斷裂口兩端其中一段重復序列，從而實現(xiàn)閱讀框修復（圖 1-2(b)）。其他研究中類似的篩選系統(tǒng)也同樣是采用一個完整的熒光基因表達盒來顯示轉染效率，后單獨或同時采用修復之后的熒光基因或藥物抗性基因來篩選核酸酶工作陽性的細胞。

1.2.2 篩選基因的基因組整合表達篩選基因的基因組整合表達又可以分為預先整合篩選基因至基因組的報告細胞系和隨供體整合兩種形式。整合篩選基因的報告細胞系多用于研究雙鏈斷裂的修復機制、比較不同供體設計的效率高低或優(yōu)化核酸酶等。在這類整合細胞系中，使用較為廣泛的是采用信號燈報告系統(tǒng)（Traffic Light Reporter, TLR）(Certo et al. 2011)制作的整合細胞系(Davis et al.2011)。該細胞系可通過不同的修復方式產生不同的熒光信號，以研究雙鏈斷裂之后的HDR 和 NHEJ 兩種修復機制各自的修復效率。TLR 報告系統(tǒng)可以通過慢病毒載體或者直接將報告系統(tǒng)載體線性化之后電轉的方式進行構建，后經(jīng)過熒光或者藥物篩選得到(Kuhar et al. 2014)。例如：Chu 等人將 TLR 報告系統(tǒng)整合至基因組的 AAVS1 位點得到單等位整合的 AAVS1TLR/+和雙等位整合的 AAVS1TLR/TLR兩種報告細胞系(Chu et al.2015)，Lin 等將其用于研究融合 RecA 的 Cas9 蛋白的基因敲除效率(Lin et al. 2017)，之圖 1-3 (a) 共打靶篩選工作原理圖；(b) HDR-USR1 載體工作原理圖Fig.1-3 (a) Function principle of co-targeting with selection; (b) Function principle of HDR-USR1 vector

正后的誘導多能干細胞克隆(Xie et al. 2014)。Ye 等人s 或者 CRISPR/Cas9 制造雙鏈斷裂，將同時具有正負篩到基因組中，隨后第二步通過轉座酶將篩選表達盒移除 et al. 2014)。但是，由于 TTAA 位點在基因組中廣泛機插入，因此在第二步負向篩選藥物 FIAU (1-(2-deox-5-iodouracil)的壓力作用下，會出現(xiàn)基因組中殘留篩選性的假陽性單克隆，且試驗結果證明，以上兩個試驗次整合概率都在 70%以上，給基因組留下了極大的安介導的重組刪除辦法系統(tǒng)之外，還存在通過兩次 HDR 完成精確編輯的策略上面兩種辦法一樣，在第一次打靶時敲入篩選標記基修復，將篩選標記基因刪除(Xi et al. 2015)（圖 1-4）。子甲基化而導致的篩選基因沉默，會降低第二步單。

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