鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)、大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)和沙門氏菌(Salmonella enteriditis,SE)是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的細(xì)菌性疾病,能導(dǎo)致鴨大批死亡,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究針對生產(chǎn)上鴨常發(fā)病原菌RA、E.coli、Pm和SE進(jìn)行多重PCR檢測技術(shù)研究,為鴨四種病原菌的混合感染和鑒別診斷提供技術(shù)支撐。藥物治療是應(yīng)對細(xì)菌性疾病的主要措施,由于抗菌藥物濫用,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加,對鴨場發(fā)病鴨進(jìn)行病原菌分離鑒定,并對分離菌進(jìn)行耐藥表型、耐藥基因檢測,掌握分離菌耐藥狀況,為臨床用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。食品動物無抗養(yǎng)殖,亟待尋找抗生素的替代品,噬菌體被廣泛關(guān)注。以鴨RA、E.coli、Pm和SE為宿主菌,進(jìn)行噬菌體分離鑒定及生物學(xué)特性研究,為噬菌體的研發(fā)、應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1.鑒別鴨源四種常見病原菌多重PCR方法的建立及應(yīng)用參考GenBank中SE inv A基因序列、RA Omp A基因序列、Pm kmt1基序列和E.coli Pho A基因序列,分別設(shè)計4對特異性引物,提取四種細(xì)菌DNA,優(yōu)化引物濃度與退火溫度,建立了多重PCR方法,且進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗,并應(yīng)用于臨床樣本檢測。結(jié)果:設(shè)計的4對引物能分別擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的片段;擴(kuò)增SE inv A基因片段、RA Omp A基因片段、Pm kmt1基片段和E.coli Pho A基因片段大小分別為830 bp、664 bp、456 bp和261 bp,與參考基因的同源性分別為98.98%、99.68%、98.76%和98.33%;優(yōu)化引物濃度為SE inv A0.25μmol/L、RA ompA 0.2μmol/L、Pm kmt1 0.15μmol/L和E.coli phoA 0.2μmol/L;退火溫度為51.4℃;多重PCR方法僅能擴(kuò)增出沙門氏菌、鴨疫里默式桿菌、巴氏桿菌和大腸桿菌的特異性條帶,而對葡萄球菌、鴨瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒的核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性;可檢測到SE 8.6 pg、RA 4.4 pg、Pm 6.0pg和E.coli 10 pg;58份臨床病料核酸樣本中檢測出RA 12.07%(7/58),E.coli12.07%(7/58),SE+RA雙陽性3.45%(2/58),RA+E.coli核酸雙陽性6.90%(4/58),Pm+E.coli核酸雙陽性5.18%(3/58)。表明建立的SE-RA-Pm-E.coli多重PCR方法具有特異性強,敏感性高、快速簡便等特點,可應(yīng)用于RA、E.coli、Pm和SE臨床感染病例的聯(lián)合檢測與鑒別診斷。2.鴨致病菌分離鑒定及耐藥性分析采集臨床病料進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng),經(jīng)形態(tài)觀察、生化鑒定、PCR檢測和動物感染試驗對分離菌進(jìn)行鑒定;采用K-B紙片法對分離菌進(jìn)行20種抗菌藥物的敏感性試驗,PCR方法對分離菌進(jìn)行氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類以及大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物共16種耐藥基因進(jìn)行檢測。結(jié)果:分離出6株菌落光滑濕潤、微隆起、邊緣整齊、呈半透明狀,染色見兩端頓圓的革蘭氏陰性短小桿菌;6株分離菌氧化酶和觸酶試驗均為陽性,且均可分解尿素,不發(fā)酵乳糖和麥芽糖,部分菌株可發(fā)酵葡萄糖(1/3)和蔗糖(1/6),甘露醇、甲基紅試驗、VP試驗、硫化氫產(chǎn)生、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽試驗均為陰性,不水解賴氨酸;SE-RA-Pm-E.coli多重PCR檢測出RA特異性條帶,PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因,擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI上公布的鴨疫里默氏桿菌的同源性均在98%以上;分離菌株感染雛鴨致死率100%(18/18),可確定6株分離菌均為致病性的鴨疫里默氏桿菌,命名為RA-SS1(2018)、RA-SS2(2018)、RA-SS3(2018)、RA-SS4(2018)、RA-SS5(2018)、RA-SS6(2018);在選擇的20種抗菌藥物中,RA-SS1對氧氟沙星和磺胺異惡唑敏感,RA-SS2對頭孢氨芐和磺胺異惡唑敏感,RA-SS3對頭孢氨芐敏感,RA-SS4對青霉素、氧氟沙星、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢氨芐、磺胺異惡唑和利福平敏感,RA-SS5對頭孢氨芐和利福平敏感,RA-SS6對頭孢他啶、頭孢氨芐和利福平敏感;在選擇的16種耐藥基因中RA-SS1檢測出aac(6’)-Ib、aph(3’)-IIa、rmt C、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS2檢測出aac(6’)-Ib、aph(3’)-IIa、rmt C、qnr A、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS3檢測出rmt C、β-DHA、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS4檢測出aph(3’)-IIa、rmt C、β-OXA、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS5檢測出aph(3’)-IIa、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因;RA-SS6檢測出aac(6’)-Ib、aph(3’)-IIa、rmt C、oqx A、oqx B和erm F基因。3.鴨主要病原菌噬菌體分離鑒定及生物學(xué)特性研究分別以沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌和鴨疫里默氏桿菌為宿主菌,采集養(yǎng)殖場污水、糞便和墊料樣品,采用雙層瓊脂平板法分離噬菌體,電鏡觀察噬菌體形態(tài),并對噬菌體的宿主譜、效價、溫度和pH穩(wěn)定性、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線及體外抑菌效果等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果:在沙門氏菌為宿主菌的雙層瓊脂平板上可見邊緣整齊、直徑約為1~2 mm的透明噬菌斑,而以E.coli、Pm和RA為宿主菌的雙層瓊脂平板未見噬菌斑;電鏡觀察噬菌體呈蝌蚪狀,頭部平面呈六邊形,直徑約100 nm,尾部長約125 nm,直徑約20 nm,分離噬菌體命名為Bp S(Bacteriophage of Salmonella enteriditis,Bp S);測定Bp S效價為1.10×10~100 pfu/mL;Bp S在溫度30℃~50℃能保持較高的活性,且30℃活性最高;pH在6~9,Bp S能保持較高活性,且pH值為7時活性最高;最佳感染復(fù)數(shù)(muhiplieity of infection,MOI)為0.01;Bp S生長潛伏期為20 min,裂解期為70 min,平均裂解量為42 pfu/cell;在3 h內(nèi)Bp S對SE有較強抑菌作用。結(jié)論:本研究成功建立了快速鑒別檢測SE、E.coli、Pm和RA的多重PCR方法;從病死鴨體內(nèi)分離到6株鴨疫里默氏桿菌,對氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢氨芐、磺胺異惡唑和利福平等抗菌藥物有較高的敏感性,對阿莫西林、恩諾沙星、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、阿奇霉素、紅霉素和新霉素抗菌藥物具有較強的耐藥性;成功分離鑒定1株沙門氏菌噬菌體,并進(jìn)行了生物學(xué)特性研究。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

細(xì)菌會不斷的變異與進(jìn)化，產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥性狀，從而與抗生素對抗。細(xì)菌耐藥機制主要有以下４種（圖1）（趙勇等，2018；Allen et al.2010）：細(xì)胞膜通透性的變化、外排泵、藥物靶標(biāo)位點突變以及產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶：

分別以 4 種細(xì)菌 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，由圖1-1A 可知，各引物均能有效擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶。對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，由圖 1-1B 可知，SE invA 基因片段大小為 830 bp，與其參考基因（載錄號：M90846.1）的同源性為 98.98%；RAompA 基因片段大小為 664 bp，與其參考基因（載錄號：FJ765044.1）的同源性為 99.68%；Pm kmt1 基因片段大小為 456 bp，與其參考基因（載錄號：AF016259.1）的同源性為 98.76%；E.coliphoA 基因片段大小為 262 bp，與其參考基因（載錄號：M29670.1）的同源性為98.53%。

貴州大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文832 bp250 bp500 bp750 bp1 000 bpM 1 2 3 4-2 000 bp100 bp663 bp460 bp261 bp圖 1-1A 單一 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 1-1A Amplification results of single PCRM：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；-：陰性對照；1：沙門氏菌；2：鴨疫里默式桿菌；3：巴氏桿菌；4：大腸桿菌M：DL 2000 DNAMarker；-：Negative control；1：S. enteriditis；2：R. anatipestifer；3：P. multocida；4： E. colia

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本文編號：2819832