發(fā)布時(shí)間：2020-09-11 19:12

　　 為研制更加安全高效的大腸桿菌疫苗,本研究以狐源致病性肺炎大腸桿菌HtrA蛋白為研究對(duì)象,克隆htra基因序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白His-HtrA,鎳柱純化重組蛋白,并檢測(cè)其免疫保護(hù)力;利用Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建大腸桿菌htra基因缺失株,研究htra基因與細(xì)菌生物學(xué)特性以及致病力之間的關(guān)系,為研究HtrA蛋白的致病機(jī)制和大腸桿菌基因工程疫苗提供參考。研究的具體內(nèi)容與結(jié)果包括:1.大腸桿菌HtrA蛋白的原核表達(dá)及免疫保護(hù)力分析本研究根據(jù)NCBI GeneBank中公布的htra基因序列,設(shè)計(jì)引物克隆出大腸桿菌htra基因;構(gòu)建pET-32a-htra表達(dá)載體,將重組載體轉(zhuǎn)化入BL21大腸桿菌工程菌中,成功表達(dá)目的重組蛋白,大小約為65 kD,Western blot方法證明該蛋白具有較好的免疫原性。將純化蛋白免疫小鼠,以2LD_(50)劑量的野生大腸桿菌攻毒,HtrA蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)力達(dá)到65%,結(jié)果表明HtrA蛋白具有作為疫苗的潛力。2.大腸桿菌htra基因缺失株的構(gòu)建和基本特性研究為探究htra基因在大腸桿菌中的作用,利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建htra基因缺失株,研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌野生型和htra基因缺失株在生長(zhǎng)速率和生化特性方面并沒(méi)有明顯差異。3.大腸桿菌htra基因缺失株生物學(xué)特性分析及毒力試驗(yàn)本研究從細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、抗巨噬細(xì)胞吞噬能力、抵抗環(huán)境應(yīng)激能力以及毒力等幾方面對(duì)突變菌株進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明,htra基因缺失株的運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、抗吞噬細(xì)胞吞噬能力以及抵抗環(huán)境應(yīng)激能力均有明顯下降。檢測(cè)htra基因缺失株的LD_(50),結(jié)果顯示缺失株的LD_(50)=3.55×10~7CFU,野生型大腸桿菌的LD_(50)=5.01×10~6 CFU,相差7倍,且缺失株引起的組織損傷較弱,說(shuō)明htra基因缺失能夠影響大腸桿菌毒力。
【學(xué)位單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

桶被稱為 LA（含 34~41 個(gè)氨基酸殘基），LB (59~64)，LC (91~102)，1（184~189），L2（214~228），L3（164~181) 。HtrA 蛋白屬與 SA 家白酶，其水解域至少與一個(gè) C-末端的 PDZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，含有 350~450殘基（圖 1-2）。

其水解域至少與一個(gè) C-末端的 PDZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，含有 350~4殘基（圖 1-2）。圖 1-1 HtrA 家族成員同源性分析Fig 1-1 Analysis of the homology of HtrA family members

蛋白 N-端具有調(diào)控功能的模塊結(jié)構(gòu)，一個(gè)是保守的胰蛋白酶樣蛋 PZD 結(jié)構(gòu)域（圖 1-3），一般具有“開(kāi)放”和“封閉”兩種狀態(tài)，模塊調(diào)節(jié)特異性蛋白之間的相互作用，優(yōu)先結(jié)合到目標(biāo)蛋白的基上[51,52]。HtrA 蛋白的 PDZ 結(jié)構(gòu)域能形成類似環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)肽在 N-端和 C-端實(shí)現(xiàn)鏈的交換。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2817062