寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)是由伊蚊傳播的黃病毒屬病毒,孕婦感染寨卡病毒后,可造成新生兒小頭癥。已有研究證實(shí)ZIKV感染為格林巴利綜合征的病因之一;由于與我國(guó)接壤的越南等國(guó)爆發(fā)了 ZIKV疫情,因此我國(guó)面臨潛在的輸入性風(fēng)險(xiǎn)。由于病毒樣顆粒(virus-likeparticle,VLP)與病毒粒子結(jié)構(gòu)相似,而且不含病毒遺傳物質(zhì),具有強(qiáng)免疫原性,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體,是最為安全有效的疫苗研發(fā)策略。本研究選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組ZIKV囊膜蛋白(Env),純化重組蛋白后,體外組裝VLP,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了 VLP疫苗免疫保護(hù)效力。目的:本研究以ZIKV囊膜蛋白(Env)為研究對(duì)象,通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得重組ZIKV囊膜蛋白,體外組裝成VLP,通過小鼠感染模型,進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證VLP疫苗侯選株保護(hù)力,為開發(fā)以VLP為基礎(chǔ),安全高效的ZKIV疫苗奠定前期研發(fā)基礎(chǔ)。方法:(1)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ZIKV囊膜蛋白,通過不同濃度zeocin抗生素,篩選高拷貝菌株。(2)誘導(dǎo)表達(dá)并純化目的蛋白,首先采用鎳離子金屬鰲合層析柱對(duì)重組目的蛋白進(jìn)行初步純化,然后通過分子篩層析進(jìn)一步的純化,通過免疫印跡(Western Blot)和質(zhì)譜檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍资欠癯晒Ρ磉_(dá)。(3)根據(jù)不同離子強(qiáng)度和pH值的VLP組裝緩沖液,篩選出VLP體外組裝的最優(yōu)條件,通過動(dòng)態(tài)光散射儀和透射電子顯微鏡鑒定VLP組裝效果。(4)將獲得的高純度ZIKVVLP免疫小鼠,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體滴度變化,確認(rèn)其體液免疫水平,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)(ELISPOT)檢測(cè)記憶性淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子;胞內(nèi)細(xì)胞因子染色,鑒定記憶性CD8+T和CD4+T細(xì)胞分泌INF-γ和IL-4能力,評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫水平,建立小鼠感染模型,攻毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ZIKV VLP疫苗侯選株對(duì)小鼠的保護(hù)力。結(jié)果:(1)構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。(2)通過Western Blot和蛋白質(zhì)譜檢測(cè),證明了 ZIKVEnv獲得成功表達(dá)。(3)通過動(dòng)態(tài)光散射儀和透射電子顯微鏡鑒定組裝效果,證明了組裝后的VLP呈球狀,與天然ZIKV粒子大小基本一致,ZIKVVLP體外組裝成功。(4)蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)證明了 ZIKV VLP能夠誘導(dǎo)生成高滴度的中和抗體,ELISPOT和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色分析,證明了可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。(5)小鼠動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn),證明了 ZIKVVLP能夠使免疫缺陷小鼠(A129)獲得致死劑量病毒攻擊的完全保護(hù)。結(jié)論:利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)ZIKVEnv,并在體外成功組裝了 VLP,免疫小鼠能實(shí)現(xiàn)完全保護(hù),本研究獲得的ZIKVVLP疫苗侯選株有望開發(fā)為一種安全高效的ZIKV疫苗。另外,還研究了可在15 min內(nèi)檢測(cè)埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)快速檢測(cè)技術(shù),將標(biāo)記膠體碳顆粒的兔多抗噴涂于玻璃纖維素膜上制備碳標(biāo)墊,以1 mg/mL的EBOV-VP40單克隆抗體(McAb,4B7F9)和羊抗兔IgG,按2 μL/cm的包被量印跡于硝酸纖維膜上,分別作為檢測(cè)線與質(zhì)控線,組裝試紙條。該試紙條能夠特異的檢測(cè)EBOV重組VP40蛋白、EBOV病毒樣顆粒(EBOV-VLP)和滅活EBOV,而與馬爾堡病毒樣顆粒(MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8(IAV/PR/8)、黃熱病毒(YFV-17D)、登革熱病毒2型(DEN2)無交叉反應(yīng),顯示良好的特異性。本研究建立的EBOV膠體碳免疫層析試紙條能夠快速、高靈敏、特異地檢測(cè)EBOV,為現(xiàn)場(chǎng)快速篩查EBOV感染提供一種新方法。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S859.797
【部分圖文】：

埃博拉病毒（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）是絲狀病毒屬，有包膜不分段的負(fù)鏈ＲＮＡ病毒。埃博拉逡逑毒顆粒有三種基本形態(tài)形式：空的，鏈接的和連續(xù)的。直徑約８０邋ｎｍ，最常見的病毒逡逑粒類型長(zhǎng)度為９８２±７９ｎｍ。埃博拉病毒基因組由七個(gè)非分節(jié)基因組成，其編碼核蛋白逡逑ＮＰ），病毒顆粒蛋白（ＶＰ３５，邋ＶＰ４０）邋［７５］，糖蛋白（ＧＰ），ＶＰ３０，邋ＶＰ２４［７６］和邋ＲＮＡ邋依賴逡逑ＲＮＡ聚合酶（Ｌ）。除ＧＰ基因外，所有埃博拉病毒基因各自編碼一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，編逡逑分泌的ＧＰ蛋白作為ＧＰ基因的主要產(chǎn)物，分泌型ＧＰ具有干擾宿主免疫反應(yīng)的能力。逡逑有兩個(gè)域，包括ＧＰ１和ＧＰ２，邋ＧＰ１含有受體結(jié)合域，而ＧＰ２含有融合蛋白和跨膜結(jié)逡逑。ＧＰ獨(dú)特的跨膜表面蛋白介導(dǎo)病毒與受體結(jié)合后進(jìn)入宿主細(xì)胞。ＶＰ２４是另一種相逡逑結(jié)構(gòu)蛋白，埃博拉病毒ＲＮＡ基因組被核蛋白包裹形成核糖核蛋白復(fù)合物。該核蛋逡逑ＶＰ３５，邋ＶＰ３０和ＲＮＡ依賴性ＲＮＡ聚合酶締合，形成功能性轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物，ＶＰ３５［７７］逡逑作為干擾素拮抗劑。核衣殼蛋白由ＶＰ２４，邋ＶＰ３０，邋ＮＰ和ＶＰ３５組成，ＶＰ２４和ＶＰ３逡逑核蛋白殼周圍的橋梁。逡逑＊＊逡逑

（１）稱量０．０１邋ｇＢＳＡ，溶于ｌＯｍＬＰＢＳ中，制成ｌ．Ｏｍｇ／ｍＬＢＳＡ；逡逑（２）用ＰＢＳ將邋１＿０邋ｍｇ／ｍＬ邋ＢＳＡ稀釋成０．２邋ｍｇ／ｍＬ、０．４邋ｍｇ／ｍＬ、０．６邋ｍｇ／ｍＬ、０．８邋ｍｇ／ｍＬ的逡逑ＢＳＡ；逡逑（３）在微孔板中分別加入１０卟梯度稀釋的ＢＳＡ，然后加入待測(cè)樣品１０邋ｐＬ，邋ＢＳＡ和待逡逑測(cè)樣品都做２復(fù)孔，最后每孔板中加入２００邋ｐＬ邋ｌｘ邋Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ濃縮液；逡逑（４）將微孔板在酶標(biāo)儀Ａ５９５ｎｍ波長(zhǎng)下讀值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。逡逑３實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑３．１高抗性重組菌株的篩選逡逑將ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ、ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ邋（ＡＴＭ）、ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ邋（Ａｓｔｅｒｎ）三個(gè)重組質(zhì)逡逑粒分別ｓａｃｌ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化Ｘ３３酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂ｌｍｇ／ｍｌ的ｚｅｃｏｉｎＹＰＤＳ平板上逡逑篩選高拷貝菌株，３０邋°Ｃ溫箱孵育７２邋ｈ，長(zhǎng)出單克隆重組畢赤酵母菌，如圖（ｆｉｇ邋２－１）。逡逑

寨卡病毒ＶＬＰ疫苗的研究及埃博拉病毒組質(zhì)粒菌液ＰＣＲ及測(cè)序鑒定逡逑物對(duì)分別對(duì)Ｚｅｏｃｉｎ？抗性平板篩選出的酵增出約１３７０邋ｂｐ的片段，均與理論大小相／ＰｒＭ／Ｅ邋（ＡＴＭ）、ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ邋（Ａｓｔｅｒｎ）ｂｐ邋Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５邋６逡逑

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