豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus PEDV)引起一類急性、高度接觸性傳染病。豬感染PEDV可引起腸道疾病,臨床癥狀主要是仔豬的腹瀉、嘔吐和脫水。目前,該病在豬場頻頻暴發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因此研究預(yù)防和治療PED的新制劑對于PED的防控具有重要的科學(xué)意義。RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象是自然界中機(jī)體的一種防御機(jī)制,它也是一種強(qiáng)大的基因沉默技術(shù)。RNAi是指生物體外源或者內(nèi)源dsRNA(double-stranded RNA)介導(dǎo)產(chǎn)生特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象,RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RTSC)降解靶mRNA。RNAi作為一種基因阻斷技術(shù),它憑借著靈敏特異性的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用在基因功能研究及人類疾病治療等領(lǐng)域。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)來抑制豬流行性腹瀉病毒在Vero細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制作用。PEDV M和N基因在不同毒株之間保守性都很高。其中M蛋白是病毒囊膜的主要組成成分,是跨膜糖蛋白,在病毒裝配過程中起到重要作用,N蛋白與病毒基因組RNA構(gòu)成螺旋核衣殼結(jié)構(gòu),在病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中起到很大的作用,同時也參與病毒顆粒組裝和釋放過程。M和N基因都是PEDV基因組中的重要基因,均參與病毒的復(fù)制。本研究以PEDV的M和N基因為靶基因,篩選出2個small interfering RNAs(siRNA)序列,然后設(shè)計1個與PEDV基因組沒有同源性的siRNA序列作為陰性對照。繼而合成編碼三對shRNA型的核苷酸鏈。將單鏈核苷酸經(jīng)過退火形成雙鏈,分別將3對雙鏈DNA連接克隆至pGenesil-1質(zhì)粒載體的啟動子下游,經(jīng)過測序成功構(gòu)建了針對PEDV特異的pGenesil-M和pGenesil-N 2個siRNA表達(dá)質(zhì)粒和1個陰性對照質(zhì)粒pGenesil-NC。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將構(gòu)成的3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞,經(jīng)G418篩選及PCR鑒定后,最終建立3個陽性重組細(xì)胞系。不同細(xì)胞系接種PEDV 48h后,檢測病毒的TCID_(50)觀察病毒滴度的變化,應(yīng)用TaqMan實時熒光定量PCR方法測定病毒的mRNA水平,Western-blotting檢測蛋白合成表達(dá)情況。在轉(zhuǎn)染特異性pGenesil-M和pGenesil-N質(zhì)粒的Vero細(xì)胞中,檢測其病毒滴度、mRNA和蛋白水平均低于轉(zhuǎn)染pGenesil-NC的陰性對照和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陽性對照。PEDV特異性pGenesil-M和pGenesil-N表達(dá)質(zhì)粒能夠不同程度地抑制病毒在Vero細(xì)胞中mRNA水平及M、N蛋白的合成,且pGenesil-N質(zhì)粒的抑制作用顯著高于pGenesil-M質(zhì)粒。綜上所述,本研究證明靶向PEDV的M和N基因的siRNA能夠有效抑制PEDV在Vero細(xì)胞內(nèi)的增殖。靶位不同的siRNA其抑制效果存在一定的差異。這些結(jié)果為研發(fā)防治PED的新制劑提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

變不明顯[27]。1.1.3 PEDV的病原學(xué)PEDV 在分類上屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、α-冠狀病毒屬（Coronavirus）。該病毒之所以稱為冠狀病毒是因為它多為球形，具有囊膜，呈皇冠狀病毒粒子。PEDV 在 4 ℃或 37 ℃溫度下 pH 6.5~7.5 能穩(wěn)定存活，外界環(huán)境對該病毒影響較大，60 ℃溫度下，半小時以上病毒就會失去感染活力，并對乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑敏感[28]。1.1.4 PEDV的基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白PEDV 單股正鏈 RNA 病毒，基因組全長約 28 kb[29]。PEDV 基因組結(jié)構(gòu)如圖 1-1 所示[30]，包含 7 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。ORF1a 和 ORF1b 較大位于 5′UTR 下游 2/3 基因組，剩下的 1/3 基因組編碼 4 個結(jié)構(gòu)蛋白分別是 S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白其中還包含一個 ORF3 非結(jié)構(gòu)蛋白[31]。研究表明，在冠狀病毒家族中的 5′UTR 還包含一個短 ORF，這個短的 ORF 編碼 3-11 個氨基酸不等，且不同冠狀病毒之間該序列與氨基酸序列存在差異，其作用是增強(qiáng)或抑制后面 ORF 的翻譯[32]。

碼子為 TTTTTT，選擇 BamH I、Hind III 酶切位點(diǎn)，是便于與 pGenesil-1 酸鏈的合成均由上海生工生物工程有限公司完成。如表 2-2。表 2-2 shRNA 序列Table 2-2 shRNA sequence序列5'-GATCCCCAACTGGTGTAACGCTAATTCAAGAGATTAGCGTTACACCAGTTGGT5'-AGCTTTTCCAAAAAACCAACTGGTGTAACGCTAATCTCTTGAATTAGCGTTACA5'-GATCCGCACCAAATGTTGCAGCATTTCAAGAGAATGCTGCAACATTTGGTGCT5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCACCAAATGTTGCAGCATTCTCTTGAAATGCTGCAAC5'-GATCCGCATTCGTATCGGTTCCATTTCAAGAGAATGGAACCGATACGAATGCT5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCATTCGTATCGGTTCCATTCTCTTGAAATGGAACCGAT質(zhì)粒pGenesil-shRNA的構(gòu)建enesil-shRNA 質(zhì)粒如圖 2-1，參照 pGenesil-1 質(zhì)粒圖譜，調(diào)控 shRNA 的啟RNA 插入位點(diǎn)是 BamH I、Hind III。構(gòu)建質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá) shRNer 酶等進(jìn)一步加工成 siRNA。

PEDVRT-PCR檢測100

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2811338