奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見的、最高發(fā)的和能引起嚴(yán)重?fù)p失的奶牛疾病之一。奶牛乳房炎不僅能降低奶牛的奶產(chǎn)量和牛奶的品質(zhì),還能引起嚴(yán)重的食品安全問題。早期對乳房炎的防治,主要是使用抗生素。但是,因?yàn)闉E用和長期使用抗生素,在治療奶牛乳房炎的同時(shí),也出現(xiàn)了一些其他的重要問題,如細(xì)菌產(chǎn)生了對抗生素的耐藥性,影響治療效果和牛奶中有過多的抗生素的殘留而引起的食品安全問題等。目前,在奶牛乳房炎的治療上,非抗生素物質(zhì)的使用越來越多,而非抗生素物質(zhì)也逐漸已成為治療奶牛乳房炎的主要藥物,其治療策略也逐步替代以前的抗生素治療�？咕�(Antibacterial peptide,ABP),是生物體內(nèi)普遍存在的一類具有強(qiáng)烈抗菌作用的小分子多肽,在機(jī)體抵抗病原入侵方面起著重要作用。抗菌肽因其獨(dú)特的抗菌機(jī)制和廣譜、高效的抗菌活性而引起普遍關(guān)注。目前,運(yùn)用基因工程方法表達(dá)抗菌肽基因,用于畜牧業(yè)中以防治家禽和家畜的某些疾病是抗菌肽應(yīng)用的熱點(diǎn),也是治療奶牛乳房炎的安全有效的手段之一。本研究通過重疊延伸PCR克隆了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽,構(gòu)建了它的原核、酵母和奶牛乳腺細(xì)胞3種表達(dá)載體,表達(dá)并純化了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽,并檢測了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽的抗菌譜及最小抑菌濃度,分析了它的序列結(jié)構(gòu)特性。此外,本研究還通過構(gòu)建奶牛乳房炎動(dòng)物模型,檢測了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽對奶牛乳房炎的防治效果。本研究首先從牛舌鱗狀上皮細(xì)胞和股骨骨髓細(xì)胞中分別克隆出牛β-防御素LAP和牛CATHL2抗菌肽,然后利用重疊延伸PCR克隆得到重組牛LAP-CATHL2抗菌肽。本研究將重組牛LAP-CATHL2抗菌肽分別克隆進(jìn)pGEX-4T-1載體、pPICZαA載體、和插入了αS1酪蛋白調(diào)控序列作為啟動(dòng)子的pCMV-C-Flag載體,分別構(gòu)建了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽的原核表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體和奶牛乳腺細(xì)胞表達(dá)載體,并將這些表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌BL21、畢赤酵母GS115和分離純化的原代奶牛乳腺細(xì)胞中。對這些表達(dá)系統(tǒng)中的重組牛LAP-CATHL2抗菌肽進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并純化得到了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽。其產(chǎn)量分別是2.83、1.16、0.114 mg/mL培養(yǎng)液。用包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌在內(nèi)的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、致病性大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes NICPBP54002)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus ATCC10987)和白色念珠菌(Nostoc)等9種菌對重組牛LAP-CATHL2抗菌肽的抗菌譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明,重組牛LAP-CATHL2抗菌肽具有廣泛的抗菌譜,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有明顯的抑菌效果,在9種測試菌中尤其對金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、無乳鏈球菌和白色念珠菌的抑菌能力最強(qiáng)。用金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、無乳鏈球菌和白色念珠菌檢測了3個(gè)不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組牛LAP-CATHL2抗菌肽的最低抑菌濃度。結(jié)果表明,原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的此抗菌肽活性最低,其對4種測試菌的最小抑菌濃度依次是500μg/mL、250μg/mL、250μg/mL和500μg/mL;酵母表達(dá)載體表達(dá)的抗菌肽對4種測試菌的最低抑菌濃度分別是125μg/mL、62.5μg/mL、62.5μg/mL和125μg/mL;奶牛乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)的抗菌肽對4種測試菌的最低抑菌濃度分別是31.25μg/mL、31.25μg/mL、31.25μg/mL和62.5μg/mL。用生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站預(yù)測分析了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽的親/疏水性、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、氨基酸序列一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)信息。結(jié)果表明,重組牛LAP-CATHL2抗菌肽既有親水性部分也有疏水性部分,屬于兩親性蛋白。此外,其序列中有明顯的跨膜區(qū)域和多個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn);在二級和三級結(jié)構(gòu)中,此抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)主要包含β-折疊,有多個(gè)正向或反向的β-折疊區(qū)域,各個(gè)β-折疊區(qū)域以其兩端的松散的成環(huán)狀的肽鏈連接。利用致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染,構(gòu)建了奶牛乳房炎的動(dòng)物模型。通過乳房灌注試驗(yàn)和乳房注射質(zhì)粒試驗(yàn)檢測了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽對奶牛乳房炎的防治效果。結(jié)果表明,乳房灌注時(shí),當(dāng)抗菌肽濃度為250 mg/mL,每個(gè)乳區(qū)每天灌注10 mL抗菌肽溶液時(shí),酵母和奶牛乳腺細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組牛LAP-CATHL2抗菌肽對奶牛乳房炎均有很好的治療效果,而原核系統(tǒng)表達(dá)的抗菌肽治療效果不明顯;乳房注射質(zhì)粒時(shí),注射奶牛乳腺細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒對奶牛乳房炎有很好的預(yù)防效果,而注射原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒時(shí),其預(yù)防效果不明顯。本試驗(yàn)成功克隆了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽,并構(gòu)建了其原核、酵母和奶牛乳腺細(xì)胞3種表達(dá)質(zhì)粒。在3種表達(dá)系統(tǒng)中均成功誘導(dǎo)表達(dá)了具有廣譜抗菌活性的重組牛LAP-CATHL2抗菌肽,原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組抗菌肽活性最低。此外,奶牛臨床試驗(yàn)表明,酵母和奶牛乳腺細(xì)胞兩種系統(tǒng)體外表達(dá)的重組抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的奶牛乳房炎有顯著治療效果,而在乳腺注射質(zhì)粒時(shí),只有奶牛乳腺細(xì)胞表達(dá)載體對奶牛乳房炎有顯著防治效果。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

-防御素 LAP 的克隆。M：DL 2000 的 DNA Marker；1-3：分別用原核表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特異性 LAP 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的牛β-防御素 LAP 條帶。B：切驗(yàn)證。M：DL 5000 的 DNA Marker；1-3：pMD-18-LAP 載體用 EcoR I 單酶切；4-6 I 和 Sal I（4 和 6）或 Kpn I（5）雙酶切。ing of bovine beta-defensin LAP. M: DNA Marker (DL 2000), 1-3: bovine beta-defenPCR used the specific LAP primers of prokaryotic expression system, yeast expressnd cell expression system; B:The verification of pMD-18-LAP vector by single and ker (DL 5000), 1-3: The pMD-18-LAP vector was enzymed by EcoR I, 4-6: The pMD by EcoR I and Sal I (4 and 6) or Kpn I (5).圖 3-2 牛 β-防御素 LAP 的克隆及 pMD-18-LAP 載體單、雙酶切驗(yàn)證loning of bovine beta-defensin LAP and verification of pMD-18-LAP vectand double enzyme成功的陽性載體進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)頁上進(jìn)行 blast 分析 3-3 中，測序結(jié)果與牛 β-防御素 LAP（Bos taurus lingual antimicrobial pquence ID: NM_203435.4）的序列 100%符合，結(jié)果說明，我們成功擴(kuò)P，且無序列突變。選擇無突變的載體轉(zhuǎn)化到 TOP10 感受態(tài)大腸桿菌，提質(zhì)粒備用。

結(jié)果與分析將連接成功的陽性載體進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)頁上進(jìn)行 blast 分析，其結(jié)果見圖 3-5。在圖 3-5 中，測序結(jié)果與牛骨髓 Cathelicidin 類抗菌肽 CATHL2（Bos taurus cathelicid2 (CATHL2), mRNA，NCBI Reference Sequence: NM_174826.3）的序列 100%符合，結(jié)果說明我們成功擴(kuò)增出了牛骨髓 Cathelicidin 類抗菌肽 CATHL2，且無序列突變。選擇無突變的載體轉(zhuǎn)化到 TOP10 感受態(tài)大腸桿菌中，LB 培養(yǎng)基搖菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒備用。

其結(jié)果見圖 3-11。在圖3-11 中，EcoR I 單酶切的樣品在的在約 4350 bp（pPICZα A 表達(dá)載體的長度約為 3600 bp，重組牛 LAP-CATHL2 抗菌肽序列的長度 750 bp，兩者之和約為 4350 bp）處有條帶，而 EcoR I和 Kpn I 雙酶切的樣品在約 3600 bp（pPICZα A 表達(dá)載體的長度）和約 750 bp（重組牛LAP-CATHL2 抗菌肽序列長度）處均有條帶，這個(gè)結(jié)果說明，重組牛 LAP-CATHL2 抗菌肽序列被成功的連結(jié)到 pPICZα A 表達(dá)載體上。陽性載體標(biāo)記為 pPICZα A-LAP-CATHL2 載體。將驗(yàn)證陽性的菌液用 LB 培養(yǎng)基搖菌擴(kuò)增，用質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬成忠;;奶牛乳房炎的中西結(jié)合治療[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;2019年04期

2 劉亞欣;;奶牛乳房炎的檢測以及防治[J];今日畜牧獸醫(yī);2019年08期

3 韓英豪;薛鴻燕;馬飛;;怎樣預(yù)防奶牛乳房炎[J];榆林科技;2007年05期

4 汪文忠;;奶牛乳房炎的預(yù)防與中藥方劑研制[J];江西飼料;2018年06期

5 魏志勝;張永峽;;中醫(yī)藥對奶牛乳房炎的治療[J];甘肅畜牧獸醫(yī);2018年12期

6 田義;;奶牛乳房炎的防治[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2018年12期

7 張海華;;奶牛乳房炎的防治[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè);2018年12期

8 朱魁元;;新鄉(xiāng)衛(wèi)濱區(qū)奶牛乳房炎防治措施分析[J];中國畜禽種業(yè);2018年12期

9 李昱潔;馬曉媛;袁昕慧;王楠;劉沂霖;邵洪澤;;一例奶牛乳房炎的診治[J];吉林畜牧獸醫(yī);2018年11期

10 李廣棟;呂東穎;田秀芝;姬鵬云;郭江鵬;路永強(qiáng);劉國世;;組學(xué)技術(shù)在奶牛乳房炎上應(yīng)用的相關(guān)研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2019年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉禎;劉光磊;;淺述奶牛乳房炎發(fā)病原因及防治技術(shù)[A];第六屆中國奶業(yè)大會(huì)論文集[C];2015年

2 張海軍;邳明偉;;中草藥防治奶牛乳房炎的對比試驗(yàn)[A];第三屆河北省畜牧獸醫(yī)科技發(fā)展大會(huì)論文集（上冊）[C];2016年

3 趙海福;馬琪;楊朝雪;王濤;趙強(qiáng);;奶牛乳房炎細(xì)菌耐藥性的中藥消除作用研究[A];第三屆中國西部動(dòng)物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2014年

4 王琴;時(shí)書寧;方炳虎;;孢洛寧防治奶牛乳房炎的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十一屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)討論會(huì)與中國毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

5 時(shí)書寧;王琴;方炳虎;;防治奶牛乳房炎的藥物研究概況[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十一屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)討論會(huì)與中國毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

6 高潮;劉國慶;趙莉莉;張崢臻;張克春;;上海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌基因分型與耐藥性研究[A];第五屆中國奶業(yè)大會(huì)論文集[C];2014年

7 褚景生;宮新城;何欣;劉寧;趙興華;;中藥內(nèi)服外涂綜合防治奶牛乳房炎[A];京津冀畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新交流會(huì)暨新思想、新觀點(diǎn)、新方法論壇論文集[C];2008年

8 房興堂;張婧敏;杜毓;張春雷;陳宏;;奶牛乳房炎抗性候選基因的研究進(jìn)展[A];《2009中國牛業(yè)進(jìn)展》論文集[C];2009年

9 李宏勝;郁杰;羅金印;李新圃;徐繼英;嚴(yán)作廷;李世宏;陳化奇;;奶牛乳房炎研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

10 房興堂;張婧敏;杜毓;石秀英;張春雷;陳宏;;奶牛乳房炎抗性候選基因的研究進(jìn)展[A];中國牛業(yè)健康發(fā)展與科技創(chuàng)新——中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第七屆養(yǎng)牛學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 獸醫(yī)專家 張守印;如何防治牛乳房炎[N];吉林農(nóng)村報(bào);2019年

2 鄭衛(wèi)軍;高溫多雨季節(jié) 謹(jǐn)防奶牛乳房炎[N];山西科技報(bào);2019年

3 本報(bào)記者 王旭;奶牛乳房炎管控關(guān)鍵在于預(yù)防[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2017年

4 無極縣東年村獸醫(yī)院 成慧奇;奶牛乳房炎的治療[N];河北科技報(bào);2016年

5 行唐縣獸醫(yī)防疫站 王金合;奶牛乳房炎的防治[N];河北科技報(bào);2015年

6 石家莊市行唐縣獸醫(yī)防疫站 王金合;夏季謹(jǐn)防奶牛乳房炎[N];河北農(nóng)民報(bào);2015年

7 張家口市畜牧技術(shù)推廣站 李海明;正確擠奶可預(yù)防牛乳房炎[N];河北科技報(bào);2015年

8 行唐縣獸醫(yī)防疫站 王金合;奶牛乳房炎的預(yù)防[N];河北科技報(bào);2013年

9 獸醫(yī)專家 張守印;牛乳房炎癥狀與治療[N];吉林農(nóng)村報(bào);2014年

10 行唐縣獸醫(yī)防疫站 王金合;奶牛乳房炎的日常預(yù)防[N];河北科技報(bào);2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王靜;重組LAP-CATHL2抗菌肽體外表達(dá)及其奶牛乳房炎的防治[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 張立梅;奶牛乳房炎性金葡菌毒力基因和耐藥性及其與SCVs致病力差異[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 杜琳;華北地區(qū)奶牛乳房炎無乳鏈球菌的生物學(xué)特性及其亞單位疫苗的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

4 戰(zhàn)永波;治療奶牛乳房炎蒙藥復(fù)方的篩選及其抗炎免疫機(jī)理的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 高樹新;BoLA基因多態(tài)性及其與奶牛乳房炎的關(guān)聯(lián)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

6 曹隨忠;應(yīng)用SSH技術(shù)篩選和克隆奶牛乳房炎抗性相關(guān)基因[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 李成應(yīng);治療奶牛乳房炎的復(fù)方中藥制劑的開發(fā)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 劉鋼;奶牛乳房炎源性淺綠氣球菌的表型、基因型和致病機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

9 吳金梅;甘草總黃酮抗金黃色葡萄球菌作用及其治療奶牛乳房炎的應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2012年

10 范鑫;奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌亞單位疫苗的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐結(jié);甘、青、寧地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌分子特性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 白東東;乳黃消口服液治療奶牛乳房炎的臨床療效及藥效學(xué)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

3 葛影影;河南省奶牛乳房炎發(fā)病規(guī)律的調(diào)查與分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 朱小云;荷斯坦奶牛炎癥相關(guān)基因多態(tài)性及其與DHI生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 王晉;吉林省泌乳奶牛不同時(shí)期營養(yǎng)需要試驗(yàn)及乳房炎病原菌調(diào)查[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

6 李麗好;奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及β-防御素4和5對其抑菌活性研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

7 楊旭斌;山西省部分規(guī)模場奶牛乳房炎及其影響因素分析[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

8 李艷坤;重組OmpA基因工程菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及遺傳穩(wěn)定性研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2018年

9 張莉莉;奶牛乳房炎主要病原菌藥物敏感性及分子特性研究[D];蘭州大學(xué);2018年

10 張亞茹;奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌與無乳鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2811055