近年來,獸用化學(xué)驅(qū)蟲藥的不合理使用現(xiàn)象普遍,導(dǎo)致家畜寄生蟲病的防治問題凸顯,其中尤以寄生性線蟲為甚,給我國畜牧業(yè)帶來了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。因此開發(fā)一種安全無副作用的新型治療家畜線蟲病的方法顯得尤為重要。值得欣喜的是,相關(guān)學(xué)者們通過不懈努力,終于發(fā)現(xiàn)線蟲的天敵——捕食線蟲性真菌對家畜線蟲病的防制具有良好的應(yīng)用前景。多年來的研究發(fā)現(xiàn),捕食線蟲性真菌在對線蟲的侵入和消解等過程中能夠分泌多種胞外蛋白酶,其中就包括絲氨酸蛋白酶。為獲得該酶的基因和啟動子信息,進(jìn)而為后續(xù)有關(guān)蛋白酶和捕食線蟲性真菌殺滅寄生性線蟲機(jī)理方面的研究提供參考資料,本研究擬以捕食線蟲性真菌的代表種—少孢節(jié)叢孢菌內(nèi)蒙古株胞外絲氨酸蛋白酶的基因及其啟動子進(jìn)行了發(fā)掘及初步分析研究,研究結(jié)果如下:(1)先擴(kuò)增少孢節(jié)叢孢菌內(nèi)蒙古株絲氨酸蛋白酶的編碼序列并構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET32a中,再轉(zhuǎn)化至Transetta(DE3)表達(dá)感受態(tài)中,進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化以及表達(dá)產(chǎn)物的純化。結(jié)果表明:少孢節(jié)叢孢菌內(nèi)蒙古株絲氨酸蛋白酶Aoz1基因可以在原核系統(tǒng)中表達(dá),其最適IPTG誘導(dǎo)濃度為1.5mmol/L,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8h,并對重組蛋白進(jìn)行了純化。(2)以少孢節(jié)叢孢菌基因組及少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因(Aoz1)為基礎(chǔ),利用BLAST對兩者進(jìn)行比對,進(jìn)而找到少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因Aoz1起始密碼子上游側(cè)翼序列,據(jù)此設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增和克隆該片段并測序,然后用啟動子在線分析軟件Promoter Scan、NNPP、Promoter 2.0及CpG島在線預(yù)測軟件EMBOSS和Meth Primer對所得序列進(jìn)行分析;結(jié)果表明,所得序列長度為2009bp,與原始序列比對后發(fā)現(xiàn)同源性為96%;在少孢節(jié)叢孢菌胞外絲氨酸蛋白酶Aoz1基因起始密碼子上游2009bp中存在啟動子的基本結(jié)構(gòu)TATA框、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及CpG島等結(jié)構(gòu)。(3)構(gòu)建重組螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic-P1和5'端缺失重組載體pGL3-Basic-P2和pGL3-Basic-P3后,分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞與HeLa細(xì)胞中,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。結(jié)果表明:少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶Aoz1基因起始密碼子上游2009bp(P1)分別在HEK-293T細(xì)胞與HeLa細(xì)胞中能顯著增強(qiáng)螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性,確定少孢節(jié)叢孢菌Aoz1基因的核心啟動子區(qū)可能位于序列P1中,為后續(xù)進(jìn)行少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶Aoz1基因的研究和少孢節(jié)叢孢菌捕食機(jī)理的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S855.9
【部分圖文】：

有組織中的表達(dá)，并且表達(dá)量基本維持恒定。對于某些絲狀真菌，利表達(dá)異源基因意義重大[39]，如構(gòu)巢曲霉中的gpd A啟動子就屬于組成異源基因的高效表達(dá)[40]；此外，在高等植物的轉(zhuǎn)基因工程中也有較多桿菌中的Nos啟動子，椰菜花葉病毒(CoYMV)的35S啟動子和Ocs啟性表達(dá)啟動子，即只能驅(qū)動基因在部分處于某種生理活動中特定的組達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，這類啟動子的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，不僅包括一般啟動子括位于上游的調(diào)控位點(diǎn)及增強(qiáng)子和沉默子等特殊結(jié)構(gòu)[38]。目前，已報(bào)表達(dá)型啟動子絕大多數(shù)都存在于植物，如葉片特異型啟動子(Fiemin粉特異型啟動子(Hamilton et al.1995)和果實(shí)特異型啟動子(Yam[42]。誘導(dǎo)型啟動子，是指在某些物理或化學(xué)因素的刺激下，對其下顯增強(qiáng)作用的一類啟動子。這種類型的啟動子的調(diào)控機(jī)制通常會受到，如果沒有誘導(dǎo)物質(zhì)的存在，其很難發(fā)揮調(diào)控功能。根據(jù)誘導(dǎo)物的不子可分為光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)和真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子等[43]。

DNA 雙鏈被解旋后順利進(jìn)入到轉(zhuǎn)錄的部位而開始合成，原核生物基圖 1[44]。對于真核生物的啟動子，根據(jù)所結(jié)合的 RNA 聚合酶的種類以及真核基產(chǎn)物，可將其分為四類：一是Ⅰ型啟動子，由 RNA 聚合酶 I 參與轉(zhuǎn)錄，錄；二是Ⅱ型啟動子，由 RNA 聚合酶Ⅱ參與轉(zhuǎn)錄，負(fù)責(zé) snRNA 和蛋白Ⅲ型啟動子，由 RNA 聚合酶Ⅲ參與轉(zhuǎn)錄，負(fù)責(zé) tRNA 和 SSRNA 的轉(zhuǎn)啟動子，可與新近報(bào)道的 RNA 聚合酶 IV 結(jié)合，該酶為植物所特有，IVb 兩種形式，可參與 RNA 聚合酶 I 介導(dǎo)的 DNA 甲基化及染色質(zhì)的修默基因轉(zhuǎn)錄[43]。在上述四種啟動子中，結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的為Ⅱ型啟動子，一，一是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，大多數(shù)為堿基 A；二是 TATA 框，處于起始位點(diǎn)多的 AT 堿基，由于其最早被 Hogness 發(fā)現(xiàn)，所以又被稱為 Hogness 框它是真核生物啟動子的核心調(diào)控元件，位于－20~－30bp 處（高等生物00bp（低等真核生物）；三是 CAAT 框，共有序列為 GGNCAATCT，功能一致，同為 RNA 聚合酶Ⅱ的結(jié)合區(qū)；四是能提高轉(zhuǎn)錄效率的增強(qiáng)

圖 3 Aoz1 基因的 PCR 擴(kuò)增條件Fig.3 The PCR amplification condition ofAoz1 gene反應(yīng)結(jié)束后，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，采用膠化 Aoz1 目的片段，具體參見天根普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒說明書得到的片段進(jìn)行電泳檢測，并使用微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000）檢測純度。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行 Aoz1 基因與平末端克隆載體 pEASY-Blunt 的連。將經(jīng) PCR 鑒定的單克隆經(jīng)菌落培養(yǎng)于含氨芐青霉素的 LB 液體中，37℃，夜培養(yǎng)后，將菌液送至華大基因測序。.2.3 Aoz1 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建將測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，詳細(xì)過程參照 Axygen 質(zhì)粒小提試劑進(jìn)行；然后使用 BamHⅠ和 HindⅢ對重組質(zhì)粒 pEASY-Blunt-Aoz1 和 pET行雙酶切。對經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒 pEASY-Blunt-Aoz1 進(jìn)行電泳，并切膠回段。對酶切后的 pET32a 載體用 EasyPure PCR Easypure PCR Purification

【參考文獻(xiàn)】

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1 鐘文強(qiáng);孟慶玲;喬軍;陳英;貢莎莎;王熙鳳;黃運(yùn)福;才學(xué)鵬;;少孢節(jié)叢孢菌胞外幾丁質(zhì)酶AO-379基因克隆及其表達(dá)分析[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2018年01期

2 李法君;;啟動子研究進(jìn)展[J];生物學(xué)教學(xué);2017年07期

3 王秋巖;何淑雅;馬云;李俐娟;李斌元;;啟動子分析方法的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年14期

4 趙海龍;孟慶玲;喬軍;陳雙慶;王國超;謝X;胡政香;才學(xué)鵬;;少孢節(jié)叢孢菌胞外絲氨酸蛋白酶P186基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2014年04期

5 李圣彥;郎志宏;黃大f ;;真核生物啟動子研究概述[J];生物技術(shù)進(jìn)展;2014年03期

6 林濤;黃建忠;;絲狀真菌啟動子研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年07期

7 杜彥艷;單保恩;;報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用[J];中華腫瘤防治雜志;2009年09期

8 石鑫;楊曉野;楊蓮茹;;殺線蟲真菌——少孢節(jié)叢孢菌胞外絲氨酸蛋白酶的研究進(jìn)展[J];畜牧與飼料科學(xué);2005年06期

9 楊曉野,楊蓮茹,汪明,劉珍蓮,考桂蘭;殺線蟲性真菌的分類與形態(tài)[J];中國獸醫(yī)科技;2003年08期

10 蘇寧,孫萌,李軼女,倪丕沖,沈桂芳;水稻葉綠體16S啟動子克隆改造、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化研究[J];植物學(xué)通報(bào);2003年03期

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1 孫豹;GhEF1A8啟動子克隆與功能分析及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

2 葉榮建;水稻組織特異表達(dá)啟動子的分離克隆、功能分析及應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 王瑞;少孢節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）捕食線蟲生化機(jī)制研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

4 蔡萌;病原誘導(dǎo)啟動子和組織特異性啟動子的分離克隆和功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

5 熊清;真核啟動子預(yù)測[D];重慶大學(xué);2004年

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1 趙海龍;少孢節(jié)叢孢菌胞外蛋白酶基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究[D];石河子大學(xué);2015年

2 王俊偉;少孢節(jié)叢孢菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的基因克隆、表達(dá)及其殺線蟲活性研究[D];石河子大學(xué);2013年

3 王為升;捕食線蟲性真菌的分離鑒定及高效菌株的篩選[D];石河子大學(xué);2013年

4 何瑩瑩;真菌強(qiáng)啟動子活性片段的克隆及轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2013年

5 王莉莉;STGC3基因啟動子的初步分析及鑒定[D];南華大學(xué);2012年

6 趙曉慧;捕食性真菌-Duddingtonia flagrans胞外蛋白酶的誘導(dǎo)與純化及其性質(zhì)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 黎晨;玉米黑粉菌cyp51基因上游啟動子克隆及功能鑒定[D];華中師范大學(xué);2010年

8 韓海賓;少孢節(jié)叢孢菌捕食器誘導(dǎo)及絲氨酸蛋白酶基因序列分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號：2810698