流感病毒的核蛋白(nucleoprotein,NP)不僅保守性較高,而且含有較多的功能區(qū),這與NP的功能密不可分。其中,存在于NP蛋白中的至少3個核定位信號(nuclear location signals,NLSs)控制著流感病毒復(fù)制過程中NP蛋白的入核過程。目前,對前兩個核定位信號(NLS1和NLS2)的功能研究報道相對較多,而鮮有報道NLS3在病毒復(fù)制增殖中的作用。通過對大流行性和季節(jié)性H1N1亞型流感病毒NP蛋白NLS3區(qū)的氨基酸序列進行比較時發(fā)現(xiàn),二者有6個氨基酸位點存在明顯差異。為此,本研究采用重疊PCR技術(shù)將這些位點進行了逐一突變,然后利用激光共聚焦和雙熒光素酶實驗研究這些位點突變對NP蛋白入核效率和聚合酶活性的影響,通過熒光定量PCR和病毒生長動力學曲線比較了所拯救病毒在細胞中復(fù)制和增殖能力的差異,以便明確NP蛋白NSL3區(qū)的這些位點對病毒復(fù)制增殖能力的影響。本研究從蛋白和病毒水平,通過體外實驗初步探討了NP蛋白NLS3區(qū)氨基酸位點突變對H1N1亞型流感病毒的NP蛋白入核、聚合酶活性、病毒復(fù)制和增殖能力等生物學活性的影響。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

第一篇 文獻綜述20，75~90 和 390~438 區(qū)域）尤為靈活，其中第三 390）開始，接著是很長一段非結(jié)構(gòu)化肽一直延殘基 420 開始與螺旋-環(huán)-螺旋重疊。這樣排列使得區(qū)和體區(qū)，在中間部分具有一些鉸鏈樣接頭，以

3、RNP 在流感病毒增殖過程中的作用A 型流感病毒的 RNP 在病毒感染周期的作用至關(guān)重要。在感染期間，A流感病毒通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入宿主細胞，并且在內(nèi)體中發(fā)生病毒融合后，將 vRNP 釋放到細胞質(zhì)中，vRNP 在核定位信號和轉(zhuǎn)運蛋白的作用下入宿主細胞核。在細胞核中，來自感染病毒的 vRNA 是合成病毒 mRNA 以及補 RNA（complementary RNA，cRNA）的模板。mRNA 合成后被運輸?shù)郊毎兄笇?dǎo)病毒蛋白合成，cRNA 留在細胞核中充當新生 vRNA 合成的中間體。在胞質(zhì)翻譯的 PB2、PB1、PA 和 NP 在其自身的核定位信號的作用下被輸送回細核中與新生的 vRNA 組裝成 vRNP。最后 vRNP 在 NP 蛋白的核輸出信號（NE和另外兩種流感病毒蛋白 M1 和 NEP 的促進作用下出核進入細胞質(zhì)。最后選擇地進入到子代病毒粒子中，通過出芽方式釋放到細胞外（如圖 3）[87]。

光素酶活性測定產(chǎn)物吹打混勻，取 20μL 加入 96 孔微孔板中，首先每孔錄 Firefly 熒光數(shù)值；隨后每孔加入 100μL Stop&Gol Re數(shù)值，聚合酶相對活性=Firefly 熒光素熒光值/Renilla 熒光計分析raphPad Prism 7.0 軟件，針對不同的數(shù)據(jù)類型采用不同的異統(tǒng)計分析，計算 p 值�！皀s”表示無顯著差異，“*”表 p<0.01，“***”表示 p<0.001，“****”表示 p<0.0001。變 NP 基因擴增結(jié)果 1.2.3.1中方法，利用 overlapping PCR方法擴增位點突變的與預(yù)期大小一致。電泳結(jié)果如圖 1.1。

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