非洲豬瘟(Africa swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)引起家豬和野豬的一種急性、熱性和高傳染性的疾病。自1921年首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情,該病已在全球數(shù)十個(gè)國家流行。2018年8月1日,我國遼寧省沈陽市首次報(bào)道ASF疫情,經(jīng)基因進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該毒株屬于基因II型,與Georgia 2007/1毒株屬于一個(gè)進(jìn)化分支。當(dāng)前疫情已在河南、江蘇、浙江、安徽、黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林、天津、香港等32個(gè)省/直轄市/特別行政區(qū)蔓延流行,造成極大經(jīng)濟(jì)損失,我國生豬業(yè)也面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。非洲豬瘟病毒基因組中約30%開放閱讀框存在多個(gè)拷貝,即多基因家族(Multigene families,MGFs)。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,MGF360家族成員12L、13L、14L可能抑制IFN所介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答,是基因缺失疫苗研制的主要靶標(biāo)之一,因此針對抑制基因建立快速準(zhǔn)確的檢測方法非常重要。研究首先根據(jù)ASFV Georgia 2007/1分離株參考序列合成MGF360-12L、-13L、-14L基因,并克隆至pcDNA3.1真核載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PK15及293T細(xì)胞,通過熒光定量PCR檢測基因?qū)FN-β(Interferon-β)表達(dá)的抑制作用,發(fā)現(xiàn)12L、13L的抑制作用較強(qiáng)。隨后以pcDNA3.1-12L、-13L重組載體為模板,分別設(shè)計(jì)4組引物,選取特異性引物進(jìn)行重組酶聚合酶(RPA)檢測方法的初步建立。結(jié)果表明,所建立的12L基礎(chǔ)RPA方法可在35℃、30 min時(shí)實(shí)現(xiàn)對目的片段的穩(wěn)定擴(kuò)增,而13L-RPA可在39℃恒溫反應(yīng)20 min完成擴(kuò)增;該方法的敏感性可分別達(dá)到10~3和10~2個(gè)拷貝,同普通PCR方法檢測限一致;此外,該RPA方法僅特異性擴(kuò)增ASFV MGF360的12L或13L基因,對PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因組沒有擴(kuò)增。使用ASFV基因組為陽性樣品進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)現(xiàn),將基因組稀釋后,12L-RPA、13L-RPA仍能檢測到目的基因的存在,表明該檢測方法具有一定的臨床價(jià)值。分別選擇pGEX6p-1、pET-21a、pET-28a、pET-32a大腸桿菌原核表達(dá)載體進(jìn)行免疫抑制蛋白12L和13L的表達(dá)。表達(dá)條件經(jīng)優(yōu)化后,表達(dá)產(chǎn)物均為包涵體形式,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以pET-21a為載體表達(dá)的包涵體蛋白溶解效果最好,純化后的蛋白濃度可達(dá)200-500μg/mL。綜上,研究基于ASFV MGF360-12L、-13L基因序列,初步建立了RPA檢測方法,可對病毒MGF360-12L、-13L基因?qū)崿F(xiàn)快速、特異性擴(kuò)增,為后續(xù)12L、13L基因缺失疫苗的鑒別診斷提供一定的技術(shù)支持。同時(shí)克隆表達(dá)并成功純化12L、13L蛋白,為后續(xù)多克隆抗體的制備、間接ELISA檢測方法的建立及相關(guān)蛋白的功能研究進(jìn)行了前期儲(chǔ)備。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

SF 的新發(fā)地和再發(fā)地，蜱蟲帶毒后，病毒在其體內(nèi)的感染能除，同一疫源地再次發(fā)病可能性仍存在，例如葡萄牙有一個(gè)發(fā) ASF，其原因在于帶毒蜱蟲的存在（Boinas FS et al.,2011）污染物等間接傳播迅速擴(kuò)散，如果未能經(jīng)妥善處理病豬的分是很危險(xiǎn)的傳染源（Sanchez-Vizcaino J M et al.,2012）。在需求量極大，但飼養(yǎng)衛(wèi)生及生豬貿(mào)易生物安全措施的有所欠缺一；其四是野豬-棲息地的循環(huán)傳播，主要包括患病與未患病與被污染的棲息地之間的間接傳播（中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)等，2018毒結(jié)構(gòu)及分類膜包被，內(nèi)含線性雙鏈 DNA，病毒呈現(xiàn)復(fù)雜的二十面體結(jié)構(gòu)毒基因組大小約為 170-190 kb，共編碼 160-175 個(gè)開放閱讀框毒顆粒包含 50 多種蛋白質(zhì)，其中主要包括結(jié)構(gòu)蛋白、早期轉(zhuǎn)ejo Aet al.,2018）。病毒組成的關(guān)鍵蛋白參見圖 1.1。

圖 1.2 RPA 擴(kuò)增反應(yīng)原理Fig.1.2 RPAamplification reaction principle常見核酸擴(kuò)增方法的比較的核酸檢測方法主要有普通 PCR、熒光定量 PCR、巢式 PCR、CPA、LA法與 RPA 之間的比較。表 1.2 常見核酸檢測方法的比較Table1.2 Comparison of common nucleic acid detection methods板類型 引物數(shù)量 酶的種類 是否需要預(yù)變性反應(yīng)溫度（℃） 反應(yīng)時(shí)間（min）DNA 2 1 是 經(jīng)過變溫過程 60-180 DNA 2 1 是 經(jīng)過變溫過程 60-180 DNA 4 1 是 經(jīng)過變溫過程 120-180 DNA 5-6 1 否 57-63 60 DNA 4-6 1 否 60-65 60-90 NA，2-3 3 否 25-42 15-30

表 2.9 熒光定量 PCR 反應(yīng)體系Table 2.9 RT-qPCR reaction system反應(yīng)組分 體積（μL）e PCR Super Mix 10ward Primer 0.8verse Primer 0.8cDNA 2變性 1 min；95 ℃變性 15 s、60 ℃退火 1線。實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，可初 基因片段的擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳，如圖 2.1 所示，紫外下發(fā)現(xiàn)大小與預(yù)期相符。

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本文編號：2810459