豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoni,PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一種引起肺部為主要病變的致死性呼吸道疾病。其PCP的傳播方式主要以豬群間通過高度接觸性和呼吸途徑傳播,目前是世界養(yǎng)豬養(yǎng)豬業(yè)五大疾病之一。臨床上其免疫預防以滅活苗進行,但存在抗菌譜窄,對肺部病變不能提供保護等缺點,所以有必要尋找新的候選疫苗。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),APP的LOLA是一種外膜蛋白,可能誘導有效的免疫保護作用,為了檢測其免疫保護效果進行了本研究。根據(jù)GenBank中已報道的APP Lola基因序列設(shè)計引物對,以APP血清Ⅰ型基因組為模版,對APP Lola基因進行PCR擴增,送至生物公司測序后,對基因序列進行生物信息學分析。發(fā)現(xiàn)該基因Lola(GenBank登陸號為Bankit MH255942)由633bp組成,編碼蛋白質(zhì)含210個氨基酸,理論分子量為2 3458 Kd,等電點為9.70;分析得出蛋白Lola為一外膜脂蛋白,其三級結(jié)構(gòu)為一網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu),包括疏水腔組成的一個閉合的β-桶和一個α螺旋蓋結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)功能上具有保持外膜穩(wěn)定,且該結(jié)構(gòu)為膜提供通透性。同源性分析表明該基因的編碼蛋白在不同的APP血清型之間同源性高,推測可以產(chǎn)生很好的交叉免疫保護效果。蛋白的N端前26個氨基酸為信號肽區(qū)。根據(jù)得到的APPLola核苷酸序列進行設(shè)計引物一對,對APPLola進行PCR擴增,下一步并亞克隆至pET32a(+)上,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后,IPTG誘導重組菌表達,得到APP rLOLA蛋白。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在23kD處出現(xiàn)特異性條帶,West-blot檢測發(fā)現(xiàn)重組菌表達的rLOLA能夠被相應(yīng)的陽性血清識別。將無菌小白鼠隨機分為6組(公母隨機),每組10只,A組為注射生理鹽水組,B組為注射弗氏不完全佐劑組,A、B組均為實驗對照組。C組注射低劑量rLOLA蛋白+佐劑劑量組,D組注射中劑量rLOLA蛋白+佐劑劑量組,E組注射中劑量rLOLA蛋白劑量組,F組注射為高劑量rLOLA蛋白+佐劑劑量組,C、D、E、F均為rLola免疫效果觀察組。隨后六組分別于第0、2、4周對小鼠進行相應(yīng)的皮下注射,總計3次。并且在每次免疫前、以及小鼠攻毒前,總計通過尾部途徑采血4次,用于測定其抗體滴度水平。在免疫周期完全結(jié)束的兩周后,通過腹腔注射對各個實驗小鼠進行APPⅠ型的攻毒感染,每只注射劑量為0.5ml每只,48h內(nèi)觀察并記錄小鼠,鑒定免疫保護效果。結(jié)果表明,免疫效果觀察組小鼠,可分別誘導免疫產(chǎn)生10%、20%、20%和40%存活率。實驗對照組則全部死亡。存活的小鼠48h后臨床狀況逐漸好轉(zhuǎn)并開始有采食行為。表明皮下注射rLOLA可以在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生免疫應(yīng)答和較高的抗體滴度水平。本研究為新型亞單位混合疫苗的疫苗成份提供了基礎(chǔ)資料。
【學位單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

件對 Lola 蛋白進行結(jié)構(gòu)和讀框分析；使用 Pfam 在線.1server 軟件分析 Lola 蛋白間結(jié)構(gòu)；ExPASy 在線軟件測質(zhì)信號肽；使用 DNAMAN不同 APP 血清型的所有氨基增模板，進行目的基因 Lola膠成像系統(tǒng)中拍照，結(jié)果可合預期結(jié)果。

圖 2-3 進化樹分析Fig.2-3 phylogenetic tree analysis of App Lola2.4 APP LOLA 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析使用 Sopma（https://npsa-prabi.ibcp.npsa_sopma）在線對 APP 的 LOLA 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，所得結(jié)果如下：可見該蛋白：α-螺旋（alpha helix）：27.36%；β 片層(extendedstrand)：26.59%；β 轉(zhuǎn)角(beta turn)：10.85%；無卷曲率(random coil)：34.91%（圖 2-4）。

圖 2-4 LOLA 的二級結(jié)構(gòu)Fig.2-4 Secondary structure of App LOLA protein使用 TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)在線對 LA 蛋白質(zhì)進行跨越膜區(qū)的預測�？梢�，App LOLA 蛋白有一膜結(jié)合區(qū)（圖 2-5圖 2-5 LOLA 跨膜區(qū)域分析Fig.2-5 Transmembrane structure of App LOLA protein

【參考文獻】

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1 夏新萌;連偉民;李成蒙;;我國部分地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型流行病學調(diào)查[J];中國豬業(yè);2015年12期

2 劉文s

本文編號：2810178