發(fā)布時間：2020-09-01 12:28

　　 反轉錄轉座子作為哺乳動物基因組主要組成部分,占哺乳動物基因組的30-45%,分為三大類:長散在的核元素(LINEs),短散在的核元素(SINEs)和長末端重復序列(LTR)。LIINE中的L1是哺乳動物基因組中含量最豐富的反轉錄轉座子,占豬基因組的17.22%,小鼠的18.78%,人類的16.89%。由于它們的普遍分布,高拷貝數(shù)和大量插入多態(tài)性,L1被認為適合在哺乳動物中開發(fā)新的分子標記。同時研究表明反轉錄轉座子是LncRNA序列的重要貢獻者。超過三分之二的成熟LncRNA序列(分別為75%和68%的人和小鼠)在其序列中含有反轉錄轉座子片段的插入。因此,本文嘗試篩選鑒定豬LncRNA基因中L1的插入多態(tài)位點,并將插入多態(tài)與豬的生長性能進行關聯(lián)分析,以開發(fā)新型有價值的轉座子插入多態(tài)分子標記,同時探究了轉座子插入對lncRNA調控靶基因的影響。結果如下:1.通過RepeatMasker獲取了1553個豬LncRNA基因內的L1插入位點,并從叢因組中獲取插入位點及兩側各800bp的序列,然后將每條序列在NCBI中與WGS庫中的基因組測序數(shù)據進行在線Blast比對,并根據結果預測每個插入位點的多態(tài)性,篩選出266個L1疑似插入多態(tài)位點,然后設計PCR檢測引物,并在杜洛克、長白豬、大白豬、二花臉、梅山豬、巴馬香豬、藏豬、野豬8個品種進行驗證。最后,我們獲得了 114個插入多態(tài)位點。其中L1A多態(tài)位點28個,L1B多態(tài)位點6個,L1C多態(tài)位點14個,L1D多態(tài)位點66個。L1D的Blast判定多態(tài)位點數(shù)占LncRNA基因中L1D總位點數(shù)的39.52%,PCR驗證有多態(tài)的占比對判定多態(tài)位點的81.44%,是L1中多態(tài)頻率最高的一個家族。2.基于獲得的114個L1插入多態(tài)位點,通過Blast鑒定L1與LncRNA之間的融合轉錄本,獲得L1和LncRNA之間的融合轉錄本總共為40個,對應28個LncRNA基因。對這些融合轉錄本進行注釋后發(fā)現(xiàn),22(55%)個LncRNA完全由L1反轉錄轉座子序列構成。3.通過RT-qPCR檢測L1-LNC-276-F10位點對應lncRNA的靶基因ERA和ERAP2在7頭具有不同插入情況的杜長大三元雜交豬的主要器官中的表達情況。結果表明,在脾臟組織中,ERAP1,ERAP2基因的表達量在純合無插入(L1-/-)的個體中高于雜合(L1+/-)和純合有插入(L1+/+)的個體。4.選擇多態(tài)性位點L1-LNC-49和L1-LNC-253-F1,在大白豬群體(462頭)進行插入多態(tài)性檢測,并與其生產性能和繁殖性狀進行關聯(lián)性分析。結果顯示,L1-LNC-49轉座子無插入個體(L1-/-)的校正背膘厚顯著大于有插入個體(L1-/+和L1+/+);L1-LNC-253-F1無插入個體(L1-/-)的同窩活仔數(shù)顯著大于有插入的個體(L1-/+和L1+/+)。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

發(fā)揮著重要作用：它們整合到新的基因組位點可改變相鄰基因的表達水平或模式，或者它逡逑可以產生新基因，從而產生更大的遺傳基因多樣性［２］。幾十年來的研宄結果表明：幾乎所逡逑有的生物體內都有轉座子的存在，但其含量存在較大的差異（如圖１）。轉座子是哺乳動物逡逑基因組的最大組分，生物信息學軟件ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ的分析結果表明，轉座子幾乎占據了逡逑人類基因組的一半［３，４］。轉座子在一些高等植物中所占比重更高，例如在玉米基因組中轉座逡逑子占到８０％。因此，對基因組中轉座成分的研究將會成為后基因組時代的研究熱點和重要逡逑研究內容。逡逑娍，．逡逑圖１．轉座子在不同生物基因組中的分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｇｅｎｏｍｅｓ逡逑１．２轉座子分類逡逑轉座子在結構和轉座機制上都表現(xiàn)出廣泛的多樣性。首先，基于轉座模式可以將轉座逡逑子分成兩大類：第一類稱作反轉錄轉座子（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ），簡稱“反座子”（ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎ）。逡逑反轉錄轉座子又被稱為ＲＮＡ轉座子，先通過轉錄產生ＲＮＡ中間體，然后反轉錄成一個新逡逑的拷貝插入到新位置

分子量ＤＬ邋２０００邋Ｍａｋｅｒ作為參照，連接電泳槽與電泳儀，用１３０Ｖ的劑的遷移位置，判斷電泳情況，電泳結束后將凝膠置于盛有溴化乙錠色１０分鐘，將凝膠拿出放到置于Ｔａｎｏｎ邋３５００全自動數(shù)碼凝膠圖像分記錄。逡逑可用性篩選逡逑統(tǒng)計電泳結果，對電泳結果進行結果統(tǒng)計顯示在８個品種豬中部分個判定為該引物在８品種豬難因組中該插入位點有多態(tài)；菜－引物在８測結果都無條帶或都有陽性條帶，則判定在８品種豬基因組中該插入的種群遺傳關系鑒定以及關聯(lián)性分析提供了依據。逡逑取質量與定量逡逑

通過ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ注解及與ＩｎｃＲＮＡ關聯(lián)分析后獲取了邋１５５３個豬ＬｎｃＲＮＡ基因內的逡逑Ｌ１插入位點及基因組序列，再通過ＮＣＢＩ數(shù)據庫進行Ｂｌａｓｔ電子篩選然后進行ＰＣＲ實驗驗逡逑證。圖４顯示的是ＬＩ邋５ＨＪＴＲ及其側翼區(qū)域序列在數(shù)據庫中與多個豬基因組序列的比對結逡逑果，其右側為轉座子序列，左側為它的側翼序列。圖４ａ，４ｂ，４ｃ表示，前幾個基因組中有Ｌ１逡逑轉座子位點插入，其余均顯示沒有找到含Ｌ１的５’ＵＴＲ序列，判定為疑似有多態(tài)；在圖４ｄ逡逑的電子篩選圖中，前面多個具有完整長度的條帶表示在多個基因組中均有該Ｌ１的插入位逡逑點，判定疑似無多態(tài)。初步篩選疑似有多態(tài)的位點信息，以供后期設計引物進行實驗驗證。逡逑最終通過ＮＣＢＩ在線Ｂｌａｓｔ比對篩選出２６６個Ｌ１疑似插入多態(tài)位點，將所設計引物在逡逑杜洛克、長白豬、大白豬、二花臉、梅山豬、巴馬香豬、藏豬、野豬８個品種，每個品種逡逑３個個體中進行多態(tài)檢測實驗。圖５為部分標記在群體中有良好多態(tài)的電泳圖結果。逡逑Ｌ邋ｌＤｌ－ｃｈｒｌ邋３：８０９２４１５８－８０９２５７１１（＋）邐ＨＡＬｌ－ｃｈｒｌｌ：９３２０９００－９３２２１９９（－）逡逑Ｉ邐３００邐６００邐９００邋ＵＯＯ邋ＩＳ００邐｛邐Ａｏ邐＇＇ｘ；邐ｒｓｓ邐ｌ邋Ａｄ逡逑

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4 王俊;圖力古爾;高興喜;;我國猴頭栽培菌株的反轉錄轉座子間擴增多態(tài)性[J];東北林業(yè)大學學報;2012年07期

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