布魯氏菌病(Brucellosis)是一種發(fā)病率較高的人畜共患性疾病,其對公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重的影響,故而對于該菌的檢測及防控顯得尤為重要。為了探索布魯氏菌快速檢測技術(shù),本研究以布魯氏菌外膜蛋白誘導(dǎo)純化為基礎(chǔ),進(jìn)行了牛源布魯氏菌膠體金試紙條的研制,具體如下:本研究將布魯氏菌三種重組質(zhì)粒pCold-TF-OMP19、pCold-TF-OMP22和pCold-TF-OMP28分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)親和層析及離子交換柱技術(shù)純化后,通過SDS-PAGE分析、ELISA方法及Western blot技術(shù)對重組蛋白OMP19、OMP22及OMP28進(jìn)行鑒定,其后使用試劑盒(BCA)測定蛋白濃度。結(jié)果表明重組蛋白OMP19、OMP22和OMP28大小分別為69 KDa、74 KDa和80 KDa,均為可溶性蛋白;經(jīng)陰離子交換柱純化后,重組蛋白的純度均達(dá)到85%以上;采用ELISA及Western blot方法鑒定重組蛋白,結(jié)果表明三種重組蛋白均有良好免疫原性和反應(yīng)活性;重組蛋白OMP19、OMP22和OMP28經(jīng)BCA試劑盒檢測濃度分別為1.1mg/mL、1.5mg/mL、1.3mg/mL。使用已純化的重組蛋白OMP22免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,通過ELISA方法對制備好的多抗進(jìn)行效價的測定。結(jié)果表明,采用ELISA方法檢測到多克隆抗體的效價為1:102400,經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果鑒定得到高純度的多克隆抗體,使用試劑盒(BCA)檢測到多克隆抗體的濃度為1.8 mg/mL。通過檸檬酸鹽還原法制備35nm膠體金溶液,然后將純化的單個OMP22蛋白和OMP19、OMP22、OMP28三種蛋白混合物分別作為膠體金標(biāo)記物,兔抗牛IgG及制備好的OMP22多克隆抗體分別作為檢測線與質(zhì)控線,并對牛源布魯氏菌膠體金免疫層析試紙條檢測方法的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示,OMP22蛋白制備的膠體金試紙條在標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋至32倍時仍可見清晰條帶,在牛源布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋至64倍時,標(biāo)記蛋白混合物制備的膠體金試紙條仍可見清晰條帶;制備的兩種試紙條與牛源的結(jié)核病、病毒性腹瀉病、藍(lán)舌病、口蹄疫、地方流行性白血病、巴氏桿菌病陽性血清均無交叉反應(yīng);與國外商品化試劑盒比較,OMP22蛋白和蛋白混合物制備的試紙條檢測結(jié)果與ELISA檢測試劑盒(IDEXX)的符合率分別為94.2%(49/52)、90.3%(47/52),與牛羊布病抗體檢測卡(KERNEL)的符合率為98%(49/50)、94%(47/50)。本研究中,制備的試紙條檢測快速、簡單,可用于現(xiàn)場檢測布魯氏菌中的抗體。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

圖 1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Fig.1 Transformations of restructuring plasmids圖 2 重組質(zhì)粒 PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplificat of restructuring plasmidsM:DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:pCold-TF-OMP19 質(zhì)粒；2:pCold-TF-OMP22 質(zhì)粒3:pCold-TF-OMP28 質(zhì)粒M:DL2000 DNA Marker;1:pCold-TF-OMP19 plasmid;2:pCold-TF-OMP22 plas

18圖 2 重組質(zhì)粒 PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplificat of restructuring plasmidsA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:pCold-TF-OMP19 質(zhì)粒；2:pCold-TF-OMP223:pCold-TF-OMP28 質(zhì)粒00 DNA Marker;1:pCold-TF-OMP19 plasmid;2:pCold-TF-OMP22 pCold-TF-OMP28 plasmid蛋白 OMP19、OMP22、OMP28 的 SDS-PAGlot 分析的鑒定2.6 方法進(jìn)行，結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白 OMP19大小為 52 KDa 的 pCold-TF 載體標(biāo)簽）大小分別為 69并均為可溶性表達(dá)，蛋白條帶大小與預(yù)期一致。經(jīng) BCAMP19、OMP22 和 OMP28 濃度分別為1.1mg/mL、1.5mg/m

圖 3 a:SDS-PAGE 電泳鑒定 b: Western blot 分析1-3:重組蛋白分別為 OMP19、OMP22、OMP28；M:蛋白分子質(zhì)量Fig.3a: SDS-PAGE analysis b:Analysis of western blo1-3:Purified recombinant proteinOMP19、OMP22、OMP28 respectively; M:Prweight Marker3.3 ELISA 對重組蛋白 OMP19、OMP22、OMP28 的鑒按照 2.7 的方法進(jìn)行重組蛋白間接 ELISA 試驗(yàn)，參照張曉娟等驗(yàn)檢測布魯氏菌陽性值最低作為判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng) S/P≥X+3SD=0.25 時，結(jié)果表明，本試驗(yàn)檢測結(jié)果與 IDEXX 試劑盒相符，同時驗(yàn)證了布魯白 OMP19、OMP22、OMP28 具有很好的反應(yīng)原性，說明三種重組蛋斷抗原應(yīng)用于牛布魯氏菌膠體金試紙條試驗(yàn)（表 2）：

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5 楊e

本文編號：2808896