腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)是一類特殊的人獸共患和食源性病原菌,它存在于正常的腸道菌群中,但卻能夠?qū)е聶C體其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生兒腦膜炎等,嚴重威脅著人和動物的健康。有效疫苗的缺乏、耐藥性的增加和生物被膜的形成給ExPEC防控帶來了巨大的困難。生物被膜(Biofilm)是細菌的一種特殊生存形式。與浮游菌不同,生物被膜能夠抵御機體的免疫清除作用,導(dǎo)致抗生素和消毒劑的作用效果下降,引起機體感染的反復(fù)發(fā)生。在食品加工設(shè)備和食品原料表面的生物被膜給食品安全造成嚴重危害。因此,研究生物被膜形成機制和控制對策具有重要意義。外膜蛋白TolC是構(gòu)成革蘭氏陰性菌外排泵的重要的成分,是細菌對多種抗菌藥的抗性的重要原因。本實驗室前期研究表明TolC蛋白缺失會造成ExEPC在M9高滲培養(yǎng)基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TolC缺失后會引起Cpx雙組份系統(tǒng)周質(zhì)間隙蛋白CpxP編碼基因的上調(diào)表達。Cpx雙組份系統(tǒng)可響應(yīng)細菌對高滲信號的識別,激活后能夠抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系統(tǒng)可能在tolC缺失后影響ExPEC生物被膜形成中發(fā)揮作用。本研究通過對△tolC菌株中Cpx雙組份系統(tǒng)感應(yīng)蛋白CpxA和效應(yīng)蛋白CpxR進行突變,探究其在△tolC菌株影響生物被膜形成中的作用。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.基因缺失菌株的構(gòu)建設(shè)計引物以ExEPC PPECC42基因組為模板擴增cpxA上下游同源臂,并通過Overlap PCR方法連接,將同源臂插入自殺性載體pRE112,轉(zhuǎn)化大腸桿菌χ7213感受態(tài)細胞構(gòu)建χ7213-pRE-△cpxA。并以此為供體菌,分別以ExEPC PPECC42野生株及△tolC株為受體菌進行同源重組,利用Cm和SacB篩選得到△cpxA基因缺失株和△tolC△cpxA雙基因缺失株。利用同樣方法,構(gòu)建△cpxR基因缺失株和△tolC△cpxR雙基因缺失株。2.回補菌株和CpxA磷酸化位點定點突變菌株的構(gòu)建以PPECC42基因組為模板,設(shè)計引物擴增cpxA基因全長,并插入pHSG396質(zhì)粒,構(gòu)建pHSG-cpxA表達載體,電轉(zhuǎn)化至△tolC△cpxA菌株中,構(gòu)建回補菌株CmA-△tolC△cpxA。運用同樣的方法構(gòu)建出Cm-R-△tolC△cpxR。通過預(yù)測和翻譯分析,找出CpxA磷酸化位點對應(yīng)的核酸序列位點,設(shè)計點突變引物以pHSG-cpxA質(zhì)粒為模板擴增出突變的質(zhì)粒,測序鑒定后電轉(zhuǎn)化△tolC△cpxA菌株中,以構(gòu)建CpxA磷酸化位點突變菌株M-A-△tolC△cpxA。3.實驗菌株的部分生物學(xué)特性研究首先測定試驗菌株的生長情況,在M9和1/2M9培養(yǎng)基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失對ExPEC的生長速率無影響,試驗菌株在8h后可以達到穩(wěn)定期。其次使用7種抗菌藥測定了試驗菌株的MIC,結(jié)果表明△tolC和△tolC△cpxA、△tolC△cpxR菌株對氯霉素和環(huán)丙沙星的敏感性顯著升高,而cpxA和cpxR單缺失對這7種抗菌藥的敏感性并未發(fā)生明顯變化。4.試驗菌株生物被膜形成能力分析使用結(jié)晶紫染色法測定試驗菌株生物被膜形成能力,發(fā)現(xiàn)在M9高滲培養(yǎng)基中與WT相比△tolC菌株生物被膜形成能力顯著下降;雙基因缺失株△tolC△cpxA、△tolC△cpxR與WT相當;回補菌株Cm-A-△tolC△cpxA和Cm-R-△tolC△cpxR生物被膜形成能力恢復(fù)到△tolC的水平;M-A-△tolC△cpxA生物被膜形成能力與WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培養(yǎng)基中均無差異。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培養(yǎng)基中試驗菌株的生物被膜形成能力與M9中類似。5.掃描電子顯微鏡觀察生物被膜細菌微觀形態(tài)使用掃描電鏡觀察試驗菌株生物被膜細菌微觀形態(tài)發(fā)現(xiàn)在1/2M9+0.06 mol/L NaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高滲培養(yǎng)基中△tolC△cpxA、△tolC△cpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈現(xiàn)與WT相似大量黏附于玻片表面,且菌體之間存在大量黏連,但△tolC菌株在玻片上黏附較少,細菌菌體之間黏連情況也較少。6.Curli菌毛合成能力分析剛果紅平板試驗表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培養(yǎng)基中,△cpxA和△cpxR單基因缺失突變株和△tolC△cpxA、△tolC△cpxR雙基因缺失株能夠形成與野生型菌株WT類似的rdar菌落形態(tài),而Cm-A-△tolC△cpxA、Cm-R-△tolC△cpxR的菌落形態(tài)與△tolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA則可以形成與WT類似的菌落。在1/2M9-CR平板上試驗菌株的菌落形態(tài)均與WT相似。這表明Cpx雙組份系統(tǒng)確實在高滲條件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的過程中發(fā)揮了作用,而且是通過抑制Curli菌毛合成而影響的。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

2. 材料與方法2.1. 材料2.1.1. 菌株與載體大腸桿菌 PPECC42 野生株，血清型 O11，屬于 B2 群菌株，分離自湖南華豬肺臟，分離時間 2006 年 7 月，小鼠毒力試驗表明為強毒力菌株，基因組全序經(jīng)測定（GeneBank ID: NZ_CM003707.1），由本實驗室分離保存。大腸桿菌 DH5α，χ7213 由本實驗室保存�；パa質(zhì)粒 pHSG396 均購自 Takara本）有限公司，其限制性圖譜見圖 2-1；自殺性載體 pRE112 由病毒室保存，其性圖譜見圖 2-2，本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒見表 2-1。

2. 材料與方法2.1. 材料2.1.1. 菌株與載體大腸桿菌 PPECC42 野生株，血清型 O11，屬于 B2 群菌株，分離自湖南華豬肺臟，分離時間 2006 年 7 月，小鼠毒力試驗表明為強毒力菌株，基因組全序經(jīng)測定（GeneBank ID: NZ_CM003707.1），由本實驗室分離保存。大腸桿菌 DH5α，χ7213 由本實驗室保存�；パa質(zhì)粒 pHSG396 均購自 Takara本）有限公司，其限制性圖譜見圖 2-1；自殺性載體 pRE112 由病毒室保存，其性圖譜見圖 2-2，本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒見表 2-1。

圖 2-3 cpxA 基因上下游同源臂重疊示意圖Fig 2-3 cpxA gene upstream and downstream homology arm splicing by overlap extension PC2.2.6.4. 重組自殺性質(zhì)粒 pRE-△cpxA 的構(gòu)建將上步回收 PCR 產(chǎn)物和提取的 pRE112 質(zhì)粒使用 SacⅠ 和 KpnⅠ進行雙酶切，酶切 3h，之后使用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收片段，然后使用 T4DNA 連接酶 片段與載體進行連接，條件為16℃連接10-12h。酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系如酶切體系：PCR 回收產(chǎn)物或載體 10μLKpnΙ 1μLSacΙ 1μLBuffer 2μLddH2O 6μL連接體系：酶切目的基因ΔcpxA 回收產(chǎn)物 6μL酶切載體 pRE112 回收產(chǎn)物 2μL

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本文編號：2808167