田鼠巴貝斯蟲(Babesia microti)是一類以硬蜱為傳播媒介,寄生在哺乳動物紅細胞的頂復(fù)門原蟲,是重要的人獸共患巴貝斯蟲病的病原。作為一新發(fā)疾病,目前的主要防治手段是阿托伐醌和阿奇霉素等聯(lián)合用藥,但是鑒于存在耐藥性和一系列副反應(yīng)的問題,有必要篩選潛在的藥物靶標,開發(fā)新的抗蟲藥物。田鼠巴貝斯蟲寄生于高氧和高鐵環(huán)境的紅細胞中,需要積極應(yīng)對胞內(nèi)惡劣的氧化壓力。硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase,TrxR)是維持氧化還原平衡的重要效應(yīng)蛋白,本實驗室前期已鑒定田鼠巴貝斯蟲僅存在一種TrxR,是重要的藥物靶標分子。因此本研究開展TrxR抑制劑對田鼠巴貝斯蟲及其蛋白質(zhì)組學(xué)變化的影響,以期探索TrxR在蟲體生長代謝的作用機制,為新型抗蟲藥物的研制提供基礎(chǔ)。本研究內(nèi)容包括以下四個方面:一、通過比較田鼠巴貝斯蟲的TrxR和宿主TrxR還原DTNB的酶活能力,和四種抑制劑對TrxR抑制效果比較,篩選對宿主酶影響較小,但對蟲體酶影響最大的抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC50(田鼠巴貝斯蟲的TrxR,11.70μM)IC50(宿主TrxR,50.77μM),表明4-NBT可以作為田鼠巴貝斯蟲TrxR的特異性抑制劑。二、建立B.microti體外短期培養(yǎng)體系。通過CCK8和紅細胞溶血實驗檢測4-NBT的細胞毒性。體外SYBR GREEN法和體內(nèi)再攻蟲法檢測B.microti的生長狀態(tài),從而判定4-NBT的抗蟲效果。通過TUNEL法觀察到4-NBT處理組的蟲體發(fā)生藍綠熒光共定位,表明蟲體基因組DNA發(fā)生斷裂。三、提取4-NBT處理的全蟲蛋白,檢測發(fā)現(xiàn)TrxR酶活比發(fā)生下降,說明天然蟲源TrxR可以被4-NBT抑制。使用流式細胞術(shù)評估蟲體孵育4-NBT的ROS變化水平,發(fā)現(xiàn)4-NBT可以顯著提高B.microti的ROS水平。此外,4-NBT處理的全蟲蛋白的丙二醛和蛋白羰基化水平顯著高于DMSO處理的全蟲蛋白,表明經(jīng)4-NBT處理的B.microti發(fā)生氧化損傷,處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。四、4-NBT和DMSO分別與體外培養(yǎng)的B.microti孵育,TrxR活性受到抑制后通過Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較蟲體蛋白表達差異�？偣茶b定到1113個蛋白,發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)2天的蛋白質(zhì)組上調(diào)蛋白180個,下調(diào)蛋白37個。體外培養(yǎng)5天的蛋白質(zhì)組上調(diào)蛋白50個,下調(diào)蛋白80個。通過對差異蛋白的GO功能注釋和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)對核糖體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工,蛋白酶體相關(guān)蛋白等,受TrxR失活的影響顯著。此外,從氧化應(yīng)激的角度分析,B.microti蛋白質(zhì),核酸,脂質(zhì)的代謝處于異常狀態(tài)。綜上所述,本研究就B.microti TrxR及其特異性抑制劑4-NBT在寄生蟲生長代謝方面的作用及其分子機制展開研究,發(fā)現(xiàn)TrxR失活后B.microti處于氧化應(yīng)激狀態(tài),活力和感染力喪失,最終走向凋亡。定量蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)核糖體,蛋白酶體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工相關(guān)蛋白受TrxR抑制的影響顯著,蟲體代謝紊亂。這些發(fā)現(xiàn)揭示了TrxR在B.microti紅內(nèi)期存活的必要性,為抗蟲藥物及其疫苗的研制提供理論參考。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.723
【部分圖文】：

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圖 2-1 重組 BTrxR 蛋白的純化Fig.2-1 Purification of recombinant BTrxR酶活反應(yīng)中 BTrxR 的濃度為 150 nM，RTrxR 的濃度為 50 nM，它們曲線如圖 2-2 所示。在該反應(yīng)體系下，加入 DTNB 后，反應(yīng)即開始進需要 30 分鐘。隨著底物的消耗，TNB 的生成，光吸收值在 412nm處。

農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 田鼠巴貝斯蟲 TrxR 抑制劑的篩選4.2 金諾芬的抑制效果比較金諾芬對兩種不同來源酶催化活性的抑制效率與濃度的關(guān)系曲線如圖 2-3 所示。金諾芬是已的 TrxR 的高效抑制劑，在低納摩爾摩爾濃度下即表現(xiàn)出對 TrxR 的高效抑制性。試驗結(jié)果表明，rxR 對金諾芬更敏感，其 IC50 僅是 4.24nM。BTrxR 隨著金諾芬濃度的升高，抑制水平升高， IC50 為 88.59nM。

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本文編號：2807701