【摘要】：奶牛乳腺炎是制約奶業(yè)發(fā)展的重要多發(fā)性疾病之一,給奶業(yè)帶來巨大損失并危及人類健康。奶牛乳腺炎的主要病因是病原菌的侵入,其中大腸桿菌(Escherichia coli)是乳腺炎最常見的環(huán)境病原菌之一。大腸桿菌作為革蘭氏陰性細(xì)菌,細(xì)胞外膜中存在內(nèi)毒素——脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中,LPS會通過發(fā)病乳腺組織進(jìn)入到血液中引發(fā)全身性炎癥以及膿毒血癥。奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為構(gòu)成乳腺先天免疫屏障的重要組成部分,在抵抗病原菌入侵方面起關(guān)鍵作用,乳腺上皮細(xì)胞凋亡對乳腺炎的免疫防御具有重要意義。研究LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為奶牛乳腺炎的防治提供依據(jù)。本研究首先利用酶消化法體外分離得到奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)并純化鑒定。其次,以此細(xì)胞為細(xì)胞模型,檢測LPS處理對細(xì)胞增殖、炎性因子分泌、凋亡的影響,結(jié)果顯示:(1)LPS抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖;(2)LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌炎性相關(guān)因子TNF-α、IL-18,且具有一定的時(shí)間依賴性(p0.01);(3)LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡,并且隨LPS處理濃度和時(shí)間的增加,細(xì)胞凋亡率也有升高趨勢。這預(yù)示著LPS可能通過炎性因子的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。再次,通過分子細(xì)胞生物學(xué)手段研究LPS誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞使TLR-4、MyD88和FADD表達(dá)增加,而Caspase-8前體蛋白表達(dá)量減少;(2)沉默MyD88基因,LPS刺激細(xì)胞炎性因子TNF-α的分泌量顯著降低(p0.01),而沉默TIRAP基因,TNF-α的分泌量無顯著變化(p0.05)。以上結(jié)果初步表明,LPS被膜受體TLR-4識別后,通過MyD88依賴型信號通路以及胞外死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最后,通過使用Rapamycin預(yù)處理細(xì)胞,探討mTORC1信號通路對LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)LPS激活奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTORC1信號通路,Rapamycin減弱LPS誘導(dǎo)的mTORC1信號通路活性;(2)Rapamycin抑制LPS誘導(dǎo)的pro-Caspase-3蛋白的裂解;(3)Rapamycin減少LPS誘導(dǎo)的MyD88、FADD蛋白表達(dá);(4)Rapamycin降低LPS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子STAT1的磷酸化水平。根據(jù)以上結(jié)果可以推測mTOR信號通路可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子STAT1來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡�？傊�,LPS可以誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡。LPS被細(xì)胞膜受體TLR4識別,募集銜接蛋白MyD88,構(gòu)成LPS/TLR-4/MyD88信號通路,激活轉(zhuǎn)錄因子STAT1,分泌炎性因子TNF-α和IL-18;LPS刺激后FADD表達(dá)水平升高,pro-Caspase-8的表達(dá)量下降,預(yù)示著LPS可能是通過經(jīng)典的死亡受體通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。mTORC1信號通路調(diào)控MyD88、FADD、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),這一過程可能是通過對轉(zhuǎn)錄因子STAT1活性的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23
【圖文】：

主要是利用消化酶（胰蛋白酶、膠原酶和透明質(zhì)酸酶或幾種酶相組織，利用含血清的培養(yǎng)基終止消化后經(jīng)濾網(wǎng)過濾、離心收集得究表明，利用膠原酶消化得到了體外可培養(yǎng) 30~40 代的奶牛乳腺細(xì)胞數(shù)量較多，培養(yǎng)周期較組織塊貼壁法短，但實(shí)驗(yàn)操作過程中化時(shí)間，否則對細(xì)胞的損傷較大[25]。圖 1.2 為通過膠原酶消化法胞。圖 1.1 組織塊貼壁法法分離得到的細(xì)胞A：成纖維細(xì)胞；B：奶牛乳腺上皮細(xì)胞Fig. 1.1 The cells were isolated by tissue-block adhesion methodA: fibroblasts; B: bovine mammary epithelial cells

是直接從新鮮的乳汁中通過反復(fù)離心獲得的乳腺上皮細(xì)胞團(tuán)是由于泌乳期，會有一些乳腺上皮細(xì)胞脫落進(jìn)入乳汁當(dāng)中。噬細(xì)胞，吞噬自身以外的雜質(zhì)來降低培養(yǎng)過程中的污染，無失[23]。利用乳汁分離法培養(yǎng)上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)的 4~6 天可見嶼狀的克隆團(tuán)。所以此法操作簡便、成本低、細(xì)胞純度較高奶的質(zhì)量及數(shù)量都有較高的要求外所分離得到的細(xì)胞數(shù)量也分離得到的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。隆(100×);B:多角形細(xì)胞(100×):C:鵝卵石狀細(xì)胞,紅色標(biāo)記為成纖維細(xì)胞與鵝卵石樣混合生長的細(xì)胞ig. 1.2 Bovine mammary epithelial cells isoltaed by collagenase digestionhe cell clone generated from a single cell (100x): B: T The polygonous celg stone cells, fibroblasts were noted by red color(100%); D: The cells withpaving stone and polygonous grew together (100)

途徑淋巴細(xì)胞（如細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞、與天然殺傷細(xì)胞），可通過多種機(jī)細(xì)胞能向靶細(xì)胞傳遞一些毒性顆粒，釋放的顆粒中包含了大量顆圖 1.4 細(xì)胞凋亡的胞外和胞內(nèi)途徑[42]途徑中 Fas 或 TRAIL 等被相應(yīng)配體激活，這些信號通過死亡受體蛋白 Fse-8。胞內(nèi)線粒體途徑主要是由細(xì)胞外的刺激等不同的信號啟動(dòng)，Bcl-2 家是胞內(nèi)途徑的重要組成部分，并含有一系列的凋亡因子。Fig.1.4 Extrinsic and intrinsic pathways of apoptosispoptosis is controlled bynumerous interrelating processes. The extrinsic pathwignals suchas Fas ligand (FasL) or TRAIL, which act through death receptors.activated through Fas-associated death domain (FADD). The intrinsic pathwaynals, primarily extracellular stimuli. Mitochondria are an essentialcomponent o harbor an array of apoptotic factors. The Bcl-2family is a primary regulator opathway.

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本文編號：2806147