【摘要】：弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)性致病寄生蟲,能夠感染包括人在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?在世界范圍內(nèi)廣泛分布,可以引起嚴(yán)重的弓形蟲腦病、眼病、流產(chǎn)、死胎等癥狀。弓形蟲在中間宿主體內(nèi)分為急性感染和慢性感染,急性感染階段以速殖子形式快速繁殖,但在免疫力正常的宿主體內(nèi),速殖子可轉(zhuǎn)化為緩殖子形式,形成組織包囊長(zhǎng)期存在于宿主機(jī)體內(nèi)造成慢性感染,目前沒有任何慢性弓形蟲病的治療手段。一旦機(jī)體免疫力下降,包囊內(nèi)的緩殖子會(huì)再活化為速殖子,再次造成宿主急性感染而導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體損傷甚至死亡。弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化是弓形蟲傳播與致病的關(guān)鍵所在,對(duì)弓形蟲緩殖子形成的機(jī)制的研究將有助于闡明弓形蟲生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理,為弓形蟲藥物和疫苗的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。本研究對(duì)已被報(bào)道發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)在緩殖子期特異表達(dá)的基因三十四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白DnaK-TPR及乳酸脫氫酶LDH2進(jìn)行功能分析及調(diào)控機(jī)制研究,以解析弓形蟲緩殖子分化發(fā)育的分子機(jī)制。對(duì)DnaK-TPR進(jìn)行基因敲除并進(jìn)行功能驗(yàn)證;確定LDH2啟動(dòng)子中的順式調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄因子,探究其在緩殖子期表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制,并對(duì)新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因敲除及功能驗(yàn)證。具體工作包括以下幾個(gè)方面:(1)DnaK-TPR敲除株的構(gòu)建及功能研究利用CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)對(duì)在緩殖子期高表達(dá)的一個(gè)三十四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白DnaK-TPR進(jìn)行基因敲除,成功獲得敲除株后進(jìn)行表型試驗(yàn),通過空斑試驗(yàn)證明敲除株與野生株的生長(zhǎng)沒有明顯差異;通過復(fù)制試驗(yàn),證明敲除株的復(fù)制能力沒有明顯缺陷;通過緩殖子分化率試驗(yàn)證明DnaK-TPR敲除后并不影響緩殖子分化;通過小鼠毒力試驗(yàn)證明敲除DnaK-TPR后與野生株相比毒力有所下降;通過對(duì)感染敲除株及野生株存活小鼠的腦包囊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)DnaK-TPR敲除株與野生型相比小鼠的腦包囊形成沒有明顯差異。因此我們猜測(cè),DnaK-TPR雖然在緩殖子期大量表達(dá),但可能該基因只是緩殖子分化發(fā)育調(diào)控機(jī)制中的一個(gè)非意向性靶標(biāo),它只是響應(yīng)緩殖子分化發(fā)育調(diào)控機(jī)制,但并不是直接參與緩殖子的分化發(fā)育過程中的靶基因。(2)LDH2基因在緩殖子期特異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究構(gòu)建LDH2啟動(dòng)子不同截短序列驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng),通過檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)效率確定了LDH2啟動(dòng)子中使其在緩殖子期表達(dá)的核心區(qū)域,并發(fā)現(xiàn)了其中一個(gè)GTGTGT重復(fù)結(jié)構(gòu)域是LDH2啟動(dòng)子中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控元件,并通過Co-IP試驗(yàn)在體外驗(yàn)證了LDH2啟動(dòng)子序列可以與AP2XI-4蛋白發(fā)生特異性結(jié)合,說明AP2XI-4可能是參與調(diào)控LDH2基因在緩殖子期表達(dá)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。為找到更多參與調(diào)控緩殖子分化發(fā)育的基因,我們通過蛋白組學(xué)分析了速殖子核蛋白與緩殖子核蛋白間的差異核蛋白,篩選到一個(gè)在緩殖子期表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子AP2Ⅻ-5。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)AP2Ⅻ-5基因進(jìn)行敲除,成功獲得了AP2Ⅻ-5基因缺失株,并對(duì)缺失株進(jìn)行表型分析,結(jié)果證明,敲除AP2Ⅻ-5后并不影響弓形蟲的復(fù)制、緩殖子分化及腦包囊形成,但敲除株的毒力卻顯著下降,不能導(dǎo)致感染小鼠死亡。定量RT-PCR結(jié)果顯示敲除AP2Ⅻ-5后BAG1、LDH2及ENO1的表達(dá)水平在緩殖子期下調(diào),證明Tg AP2Ⅻ-5可能參與一些與緩殖子分化發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控。說明AP2Ⅻ-5是調(diào)控弓形蟲毒力的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,且參與LDH2等緩殖子相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.72
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文感染(Dubey 2008)。弓形蟲在中間宿主體內(nèi)完成無性生殖階段，在形蟲有速殖子和緩殖子兩種形態(tài)。中間宿主經(jīng)口吞食感染性卵囊子逸出并入侵腸壁細(xì)胞，以速殖子形式隨血液或淋巴系統(tǒng)移行至全新的細(xì)胞，在宿主免疫能力缺陷時(shí)，速殖子可快速大量復(fù)制，從而傷和炎癥反應(yīng)，造成急性感染；但若在健康宿主體內(nèi)，在宿主強(qiáng)有用下，速殖子可以轉(zhuǎn)化為半休眠狀態(tài)的緩殖子形式，其蟲體繁殖能細(xì)胞中形成組織包囊逃避宿主的免疫作用，并可在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期存活使宿主終生帶蟲。最終貓及貓科動(dòng)物捕食及攝入含有組織包囊的中形蟲的整個(gè)生活史（圖 1-1）。人類在整個(gè)弓形蟲生活史中并不是典卻很容易通過食入未煮熟的含有組織包囊的肉制品或飲用被卵囊污,繼而引發(fā)弓形蟲眼病、腦病、流產(chǎn)等癥狀(Jones and Dubey 2l., 2015)。

圖 1-2 體外弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化的影響因素（Lyons et al., 2002Fig.1-2 Factors associated with tachyzoite and bradyzoite interconversion in v（Lyons et al., 2002）形蟲緩殖子分化發(fā)育的分子機(jī)制研究進(jìn)展蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化的機(jī)制是目前弓形蟲領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與、核酸微陣列等分子生物學(xué)技術(shù)的推廣應(yīng)用，及基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組在弓形蟲領(lǐng)域的運(yùn)用為闡明這種轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了新的技術(shù)和方法，到解析，將對(duì)弓形蟲病的檢測(cè)、新型疫苗的設(shè)計(jì)和藥物的研發(fā)提供新他頂復(fù)門原蟲具有重大的理論指導(dǎo)意義。殖子與緩殖子期差異表達(dá)蛋白研究進(jìn)展蟲速殖子轉(zhuǎn)化為緩殖子的過程中，伴隨著形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和分子生物學(xué)一些階段特異性抗原和新陳代謝發(fā)生變化(Denton et al., 1996, Fergu

殖子體內(nèi)并不存在得以證明(Coppin et al., 2003)。基因表達(dá)分析也表明糖酵解在速殖子和緩殖子期被差異化調(diào)節(jié)，且參與糖酵解的多個(gè)酶均有兩個(gè)亞型且在兩個(gè)時(shí)期的表達(dá)有顯著差異，如圖1-3所示（數(shù)據(jù)來源于ToxoDB數(shù)據(jù)庫(kù)），其中以烯醇酶和乳酸脫氫酶最為突出，ENO1和LDH2在緩殖子期特異表達(dá)，ENO2和LDH1在速殖子期大量表達(dá)(Dzierszinski et al., 1999, Yang and Parmley 1997)，從酶動(dòng)力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LDH在緩殖子期的酶活性明顯高于速殖子期，ENO1和ENO2的Km值相似，但ENO2的Vmax值確是ENO1的三倍，說明在這兩個(gè)時(shí)期蟲體的碳水化合物代謝機(jī)制存在差別

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張加勤;侯香華;宋秀宇;;弓形蟲乳酸脫氫酶LDH2基因啟動(dòng)子的克隆及鑒定[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2013年04期

2 吳q;王瓊;郝麗;程璐;陳曉光;;弓形蟲RH株體外培養(yǎng)及速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化體系的建立[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2008年07期

本文編號(hào)：2805266