【摘要】：鴨瘟是由鴨瘟病毒(DPV)引起的禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種基因編輯技術(shù),CRISPR相關(guān)蛋白9能對目的基因片段進(jìn)行準(zhǔn)確切割。本研究以DPV的UL23以及US10基因為靶點,通過特定引物分別擴增出UL23、US10的左右同源臂,利用PUC19-EGFP構(gòu)建出重組質(zhì)粒PUC19-UL23-EGFP和PUC19-US10-EGFP,采用PCR方法將其線性化為目的基因片段UL23(AB)-EGFP和US10(AB)-EGFP。進(jìn)而設(shè)計合成UL23、US10的gRNA(單向RNA),利用PX-330質(zhì)粒分別構(gòu)建出PX-330 Cas/gRNA(PX330-UL23-Cas9/gRNA質(zhì)粒、PX330-US10-Cas9/gRNA質(zhì)粒)。隨后分別將對應(yīng)的將線性化的目的基因片段、以及PX-330 Cas/gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到雞胚成纖維細(xì)胞。根據(jù)綠色熒光蛋白表達(dá)情況、細(xì)胞病變情況結(jié)合蝕斑純化技術(shù)以及PCR方法最終拯救出缺失UL23、US10基因的重組鴨瘟病毒△UL23和△US10。實驗結(jié)果為鴨瘟新型疫苗的研發(fā)奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

我國于 1957 年由黃引賢報道此病在廣部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)本病的流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科。病毒粒子呈近球膜較大病毒，核酸為線性、雙股 DNA，其主要由四外模、囊膜（如圖 1）[3]。DPV 對外界環(huán)境的抵抗死亡，高溫天氣陽光直射的條件下，9h 其毒力降低、強堿敏感，胰蛋白酶、脂肪酶處理可使病毒失一致，囊膜表面沒有紅細(xì)胞凝集素，不具有血凝性鴨體的各個器官、血液、分泌物及排泄物中，其中高。DPV 能在 9-11 日齡的鴨胚中繁殖和傳代，4-6d且死亡鴨胚呈現(xiàn)充血、出血、尿囊膜和肝臟上出現(xiàn)胚中連續(xù)傳代后病毒也能感染雞胚，可以在雞胚成病毒感染細(xì)胞后在 26-30h 細(xì)胞出現(xiàn)病變，形成核內(nèi)度最高[4]。

CRISPR-Cas9 技術(shù)CRISPR-Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRiated protein 9)技術(shù)中 CRISPR 序列的發(fā)現(xiàn)是最早是在大腸桿菌中由一位日家發(fā)現(xiàn)的，發(fā)現(xiàn)之后由于其功能無法定論所以該發(fā)現(xiàn)一直沒有得到科研工心。到了 1995 年時，西班牙科學(xué)家在對地中海極嗜鹽菌(Haloferar me)和對沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haloferar volcanii)的研究中第 2 次發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)人們又在其他一些細(xì)菌的研究中發(fā)現(xiàn)這種相似的遺傳結(jié)構(gòu)，從此對 CRIS報道開始增多了起來。通過分子生物技術(shù)的突飛猛進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)了這段序細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組當(dāng)中都存在著，這就引起了大眾的興趣。為了準(zhǔn)確系列串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特點，深入研究其功能，R.Jansen 等.將其正式命PR 并一直沿用至今[18]。

圖 3 CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的基因編輯模式[19]Fig 3 Schematic of genome editing by CRISPR-Cas9[19]ISPR-Cas9 靶位點的選擇及相關(guān)工具點的選擇是基因編輯技術(shù)的首要問題。在 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中，端存在 PAM 位點，它才能夠被 crRNA 準(zhǔn)確識別。每 8 個堿基就PAM 位點，這在一定程度上對靶位點的選擇有所限制，但同時也識別效率[20]。張鋒實驗室建立的網(wǎng)站可以提供堿基序列中的靶位目的和意義來隨著我國養(yǎng)鴨業(yè)的大力發(fā)展，部分地區(qū)鴨瘟的流行造成了很大仍是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要病毒之一。目前鴨瘟的接種疫苗主要是滅毒疫苗，滅活疫苗產(chǎn)量少且成本較高、免疫期短。雖然雞胚化弱活疫苗的缺點，但是可能出現(xiàn)毒力返強。此外，雞胚化弱毒疫苗率逐漸增高的隱患。因此，研制更加有效、安全、多價的鴨瘟疫

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2802525