【摘要】：益生菌是一種可以替代抗生素的安全的飼料添加劑,添加到飼料中能夠預(yù)防疾病并促進機體生長。而芽孢桿菌因為能夠產(chǎn)生芽孢,在極端環(huán)境以及長期儲存過程中保證活菌數(shù),成為益生菌的熱選之一�？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)能夠產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì),比如氨基酸、維生素K、維生素B12,促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)吸收,提高生長性能。其次B.subtilis能夠快速消耗腸道中的氧氣,維持厭氧環(huán)境,促進厭氧有益菌的生長,抑制需氧有害菌生長。先天性免疫系統(tǒng)是機體抵御各種病原微生物入侵的第一道防線。模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)與病原微生物的識別和清除有關(guān),NOD樣受體(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)是其中重要的一個家族,是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子。NLRs能夠識別B.subtilis,從而激活炎癥反應(yīng)促進細胞因子分泌。但是B.subtilis誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答機制尚不清楚。為了尋找替代抗生素的優(yōu)良益生菌,本研究從土壤中分離B.subtilis,并進行篩選。首先為了確認(rèn)菌株在胃腸道適應(yīng)性存活力,進行了耐胃酸、耐腸液、耐膽鹽試驗;為證明其抑菌能力,進行了革蘭氏陽性、陰性菌抑制試驗,闡明菌株的抗感染的性能;為驗證B.subtilis在體內(nèi)抑制病原菌的抗感染效果,以家兔為實驗動物進行飼喂試驗,顯示其對兔生長性能、免疫球蛋白、免疫器官指數(shù)、腸道菌群、免疫應(yīng)答以及抗細菌感染有顯著作用,確認(rèn)飼料添加益生菌能夠代替抗生素,展示了良好的產(chǎn)業(yè)前景;為進一步揭示其抗感染的機制,通過檢測NLRs以及下游免疫基因表達發(fā)現(xiàn),B.subtilis可以通過激活兔NOD1(rNOD1)介導(dǎo)宿主抗細菌感染免疫應(yīng)答。我們克隆了rNOD1,探究rNOD1介導(dǎo)的信號通路及其抑菌活性,并確定r NOD1在抗細菌感染過程中的作用。本研究分為以下4部分:1.枯草芽孢桿菌的分離鑒定和體外益生性能的評估本研究中,根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗、16S rRNA鑒定,我們從土壤中分離到具有典型火山口形狀的革蘭氏陽性B.subtilis 180株。所有菌株進行體外人工胃液、腸液、膽鹽耐受試驗后,篩選到68株耐受良好的B.subtilis。在此基礎(chǔ)上,對68株菌進行功能性篩選,包括抑菌能力(產(chǎn)ESBL大腸桿菌、腸道致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)和產(chǎn)酶活性試驗。其中BYS2、BQ3、BD17在篩選的68株B.subtilis中對致病菌的綜合抑制能力最強。B.subtilis對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制能力是最強的。尤其是對產(chǎn)氣莢膜梭菌,抑菌圈直徑能達到20-30mm。BYS2、BQ3、BD17對于金黃色葡萄球菌抑制圈直徑都大于20mm,對沙門氏菌抑制能力稍弱,BQ3抑菌圈最高達到18.1±1.7mm,對大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)的抑菌圈直徑12-14mm。而且對產(chǎn)ESBL大腸桿菌的也有相同的抑菌能力。最后進行抗生素敏感試驗,確定其不攜帶耐藥基因。最終,我們選擇了3株抑菌能力最強(BYS2、BQ3、BD17)和2株產(chǎn)酶能力最強(BG5、BGY12)的B.subtilis進行體內(nèi)飼喂實驗,探究B.subtilis對機體的益生效果。2.體內(nèi)評估枯草芽孢桿菌對機體生長性能、免疫調(diào)節(jié)及腸道菌群的影響飼喂10~6 CFU g~-11 B.subtilis組顯著提高了新西蘭大白兔的平均增重以及血清中免疫球蛋白IgG和IgA(P0.05)。飼喂5周后,添加10~6 CFU g~-11 B.subtilis組與對照組相比,兔的胸腺和脾臟相對重量顯著增加(P0.05)。飼喂B.subtilis 5周和7周后,通過高通量測序?qū)彝妹つc內(nèi)細菌16S rRNA V3-V4區(qū)進行分析。通過α多樣性分析,飼喂B.subtilis后盲腸菌群的物種多樣性高于對照組。對門水平物種進行分析,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)占全部序列的95.0%-96.5%。Firmicutes的相對豐度在飼喂益生菌5周、7周后有上升的趨勢,而Bacteroidetes的相對豐度飼喂益生菌5周、7周后顯著下降(P0.05)。腸道菌群在門水平的差異是屬水平的變化引起的。對照組家兔盲腸菌群在屬水平排名前十為瘤胃球菌屬(Ruminococcus)8.13%、顫螺菌屬(Oscillospira)4.62%、擬桿菌屬(Bacteroides)5.20%、Akkermansia 3.46%、糞球菌屬(Coprococcus)1.28%、梭菌屬(Clostridium)1.12%、Faecalibacterium 0.59%、脫硫弧菌(Desulfovibrio)0.23%、Parabacteroides 0.38%、Dorea 0.39%。飼喂B.subtilis 5周后,家兔盲腸菌群在屬水平排名前十為Ruminococcus 12.00%、Oscillospira 4.19%、Bacteroides 0.69%、Akkermansia1.18%、Coprococcus 0.76%、Clostridium 1.05%、Faecalibacterium 0.49%、Desulfovibrio0.20%、Parabacteroides 0.10%、Dorea 0.17%。飼喂B.subtilis 7周后,家兔盲腸菌群在屬水平排名前十為Ruminococcus 9.61%、Oscillospira 7.50%、Bacteroides 1.57%、Akkermansia 0.65%、Coprococcus 2.54%、Clostridium 0.24%、Faecalibacterium 0.23%、Desulfovibrio 0.38%、Parabacteroides 0.21%、Dorea 0.05%。飼喂B.subtilis后促進腸道菌群平衡和腸道消化功能,維持腸道健康。其中,Ruminococcus是腸道中的重要菌群,有利于協(xié)助纖維素的消化與吸收。本研究中,Ruminococcus在飼喂B.subtilis 5周后,相對豐度顯著增加(P0.05)。Bacteroides在飼喂B.subtilis 5周、7周后相對豐度顯著下降(P0.05),Clostridium在飼喂B.subtilis 7周后相對豐度顯著下降(P0.05)。這一結(jié)果表明飼喂B.subtilis一定程度上促進腸道有益菌生長,抑制致病菌的生長。綜上所述,飼喂B.subtilis后提高了兔生長性能、免疫球蛋白、免疫器官指數(shù)以及盲腸微生物菌群的多樣性,促進腸道健康。3.枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及提高機體抗病力本實驗首次研究了B.subtilis對于兔先天性免疫應(yīng)答的研究。為了研究飼喂B.subtilis后誘導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答,在飼喂5周和7周后,采用熒光定量PCR的方法檢測脾臟和空腸的免疫相關(guān)基因。飼喂B.subtilis后,模式識別受體NOD1、NLRC3、NLRX1表達上調(diào)。下游的促炎因子IL-1β、IL-8和IFN-γ以及β防御素表達量也都增加。飼喂7周后進行腸出血性大腸桿菌攻毒,飼喂B.subtilis組兔的存活率顯著高于對照組(P0.05)。而且,飼喂B.subtilis組兔盲腸內(nèi)容物中的E.coli數(shù)量顯著低于對照組(P0.05)。飼喂B.subtilis組的NLRs和β防御素顯著上調(diào),尤其是DEFB114、DEFB134、DEFB135。而β防御素表達量的增加能夠直接殺滅病原微生物,從而增強機體抗感染能力。另外,我們在體外將兔腎(RK-13)細胞與B.subtilis共培養(yǎng)后得到相似的結(jié)果。刺激B.subtilis后,RK-13細胞中的rNOD1以及下游促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和β防御素DEFB124、DEFB125、DEFB128表達量顯著上調(diào)。但是,通過干擾RNA敲低rNOD1后,B.subtilis不能誘導(dǎo)促炎因子以及防御素的表達。這一部分結(jié)果表明了B.subtilis可以通過激活rNOD1誘導(dǎo)下游促炎因子以及β防御素的表達從而提高機體抗病力。因此我們接下來深入探究,B.subtilis激活rNOD1后誘導(dǎo)的下游信號通路。4.rNOD1介導(dǎo)的信號通路以及在大腸桿菌感染過程中的作用NOD1是NLRs中最重要的一員,在哺乳動物先天性免疫系統(tǒng)中是識別外源病原微生物以及內(nèi)源性分子的細胞內(nèi)受體。本試驗以RK-13細胞的cDNA為模板,成功克隆rNOD1,rNOD1含有3個保守結(jié)構(gòu)域:N端的CARD(caspase activation and recruitment domain)結(jié)構(gòu)域,中間的NACHT結(jié)構(gòu)域,C端的7個LRR(leucine-rich repeat domain)結(jié)構(gòu)域。rNOD1在兔的各組織器官中廣泛表達,在E.coli感染過程中,脾臟、肝臟和腎臟中rNOD1的表達量顯著增加,表明機體能夠迅速識別外來病原,并誘導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答。過表達rNOD1后,能夠激活NF-κB,并誘導(dǎo)下游促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α以及α防御素NP5和β防御素DEFB124、DEFB125、DEFB128、DEFB135表達。過表達rNOD1后顯著抑制E.coli的增殖,相反,敲低rNOD1后,E.coli的增殖顯著增加(P0.05)。而抑制NF-κB后,rNOD1對E.coli的抑制能力喪失,且顯著促進了E.coli的增殖(P0.05)。表明,rNOD1通過激活NF-κB信號通路來介導(dǎo)其抑菌活性。進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達rNOD1后顯著增加E.coli感染過程中誘導(dǎo)促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ及β防御素DEFB124、DEFB125、DEFB128的表達,但是敲低rNOD1后這些基因的表達都減少。而且抑制NF-κB后,rNOD1失去誘導(dǎo)下游促炎因子以及防御素的功能。綜上結(jié)果表明,rNOD1通過激活NF-κB信號通路介導(dǎo)其抑制E.coli的免疫應(yīng)答。另外,r NOD1與自噬蛋白LC3存在共定位的現(xiàn)象,過表達rNOD1后感染E.coli,自噬蛋白LC3-Ⅱ顯著增加(P0.05),表明rNOD1通過誘導(dǎo)自噬,在抑制E.coli感染中起重要作用�；诖�,rNOD1及其配體iE-DAP將來可能發(fā)展為疫苗佐劑和藥物開發(fā)的新靶點。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.291

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本文編號：2801944