【摘要】：卵母細(xì)胞體外成熟是體外輔助生殖技術(shù)中重要的一步,然而體外環(huán)境因素,比如氧氣濃度等,制約卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量。沒(méi)食子酸(Gallic Acid,GA)是一種廣泛存在于界植物中的有機(jī)酸,研究發(fā)現(xiàn),其具有很強(qiáng)的抗氧化能力,能夠幫助細(xì)胞清除自由基,起到保護(hù)細(xì)胞的作用。但是目前尚未有研究報(bào)道關(guān)于沒(méi)食子酸對(duì)生殖細(xì)胞的保護(hù)作用,而且關(guān)于沒(méi)食子酸的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。因此,本研究通過(guò)探討沒(méi)食子酸對(duì)黃牛卵母細(xì)胞體外成熟及其后續(xù)IVF胚胎發(fā)育的影響,同時(shí)研究其可能的作用機(jī)制,為進(jìn)一步完善黃牛卵母細(xì)胞體外成熟體系提供理論依據(jù)。首先探討了沒(méi)食子酸對(duì)黃牛卵母細(xì)胞體外成熟及其后續(xù)IVF胚胎發(fā)育的影響。黃牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus Oocyte Complexes,COCs)在添加有不同濃度(0、10、30、50、100 μmol/L)沒(méi)食子酸的體外成熟液(M液)中培養(yǎng)22-24 h后,統(tǒng)計(jì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況及卵母細(xì)胞的第一極體排出率;隨后,將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精(In Vitro Fertilization,IVF),分別統(tǒng)計(jì)早期胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示,M液中添加30 μmol/L濃度GA組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展分值和卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著高于0 μmol/L對(duì)照組(P0.05),其他處理組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P0.05);隨后,IVF胚胎發(fā)育結(jié)果顯示,各處理組的胚胎卵裂率和囊胚率與對(duì)照組相比均有所提高,其中30 μmol/L組的卵裂率、囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù)均顯著高于0 μmol/L對(duì)照組(P0.05),但是其囊胚細(xì)胞凋亡率與0 μmol/L對(duì)照組相比差異不顯著(p0.05)。其次根據(jù)各濃度沒(méi)食子酸的處理效果,選擇了 30μmol/L GA處理黃牛COCs 22-24 h,探討了其可能作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):相比0μmol/L對(duì)照組,30 μmol/L的GA處理可以顯著降低卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧的熒光強(qiáng)度(16.65±4.03 VS 10.80±3.36,p0.05);對(duì)抗氧化酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn),30 μmol/LGA可以顯著提高卵母細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量(0.00498±0.00091 VS 0.00777±0.0010 pmol/oocyte,P0.05)和過(guò)氧化氫酶水平(0.51726667±0.845 VS 1.169166654±0.845 U/mg蛋白,P0.05)。對(duì)NF-κB信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn),GA引起的黃牛卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降會(huì)減弱對(duì)NF-κ B信號(hào)通路的刺激,并顯著性降低了卵母細(xì)胞內(nèi)NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)水平(p0.05)。而結(jié)合熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)NF-κ B信號(hào)通路受到抑制后可能促進(jìn)了下游超氧物歧化酶1(Superoxide Dismutasel,SOD1)和谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(Glutathio ne Peroxidase 4,GPX4)等抗氧化酶基因的mRNA 表達(dá)(p0.05)。此外,探討了黃牛COCs體外成熟過(guò)程中,沒(méi)食子酸對(duì)卵丘細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比0 μmol/L未處理組,30 μmol/LGA也可以顯著性降低卵丘細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和顯著性提高總谷胱甘肽及過(guò)氧化氫酶含量(p0.05)。熒光定量結(jié)果顯示,30 μmol/L處理組的卵丘細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因(Bax、Bad)mRNA表達(dá)受到了抑制,而卵丘擴(kuò)展基因(PTGS2/PTX3/HAS2F/TSG6)、抗凋亡基因(Bc12)、增殖基因(spyl/spy2/spy3)及抗氧化基因(GPX4和SOD1)mRNA表達(dá)得到了顯著提高(p0.05)。最后,探討了沒(méi)食子酸對(duì)黃牛卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體含量的影響。熒光定量PCR和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,黃牛卵母細(xì)胞成熟階段,30 μmol/L沒(méi)食子酸的處理可以顯著提高線粒體轉(zhuǎn)錄因子PGC-1 α、TFAM、UCP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄和線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM蛋白的翻譯(P0.05),促進(jìn)了線粒體的生物合成。上述結(jié)果表明:(1)體外成熟液中添加30 μmol/L沒(méi)食子酸可以促進(jìn)黃牛卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量及其后續(xù)胚胎的發(fā)育;(2)沒(méi)食子酸促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟可能是通過(guò)以下途徑發(fā)揮作用:α,清除細(xì)胞內(nèi)活性氧,抑制活性氧引起的NF-κB信號(hào)通路激活,提高自身抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力;b,沒(méi)食子酸可以促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖、擴(kuò)展,降低卵丘細(xì)胞凋亡,維持其正常生理功能狀態(tài),進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟;c,沒(méi)食子酸可以促進(jìn)卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的生物合成,提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823.81
【圖文】：

１０．邋８０±３．邋３６，Ｐ＜０．邋０５）。逡逑°，魯邐５５ＢＢ｜１５．邋丁逡逑圖２－１細(xì)胞內(nèi)活性氧含量檢測(cè)；圖２－１Ａ，卵母細(xì)胞明場(chǎng)光與ＲＯＳ熒光圖；圖２－１Ｂ，活性氧相對(duì)熒光強(qiáng)度逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ＲＯＳ；邋Ｆｉｇ２－１Ａ，邋Ｂｒｉｇｈｔ邋ｆｉｅｌｄ邋ｌｉｇｈｔ邋ａｎｄ邋ＲＯＳ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｏｏｃｙｔｅ；逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－１Ｂ，邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑＊注：不同字母標(biāo)注代表差異顯著（戶＜０．邋０５）。逡逑＊Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅｒｅ邋ａｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｍａｒｋｓ邋（尸＜０．０５）．逡逑３４逡逑

逑／邐／逡逑圖２－３卵母細(xì)胞過(guò)氧化氫酶含量（單位：Ｕ／ｍｇ蛋白）逡逑Ｆｉｇ２－３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｃａｔａｌａｓｅ邋ｉｎ邋ｏｏｃｙｔｅ邋（ｕｎｉｔ：邋Ｕ／ｍｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）逡逑＊注：不同字母標(biāo)注代表差異顯著（Ｐ＜０．邋０５）。逡逑＊Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅｒｅ邋ａｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｍａｒｋｓ邋（＾＜０．０５）．逡逑３５逡逑

逡逑圖２－２卵母細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量（單位：ｐｍｏｌ／卵母細(xì)胞）逡逑Ｆｉｇ２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ＧＳＳＧ邋ａｎｄ邋ＧＳＨ邋ｉｎ邋ｏｏｃｙｔｅ邋（ｕｎｉｔ：邋ｐｍｏｌ／ｏｏｃｙｔｅ）逡逑＊注：不同字母標(biāo)注代表差異顯著（Ｐ＜０．邋０５）。逡逑＊Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅｒｅ邋ａｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｍａｒｋｓ邋（Ｐ＜０．０５）．逡逑２．邋３成熟液中添加沒(méi)食子酸對(duì)黃牛卵母細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶含量影響逡逑根據(jù)前面不同ＧＡ濃度處理處理效果，選擇３０邋Ｗｎｏｌ／Ｌ邋ＧＡ處理未成熟的黃牛逡逑ＣＯＣｓ邋２２－２４ｈ后，檢測(cè)卵母細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相比對(duì)照組，ＧＡ逡逑可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶水平（０．５１７２６６６７±０．邋８４５邋ＶＳ邋１．１６９１６６６５４邋士逡逑０．８４５邋Ｕ／ｍｇ邋蛋白，Ｐ＜０．邋０５）；逡逑１．５－１逡逑Ｃ３０逡逑＾邐ａ逡逑；＝＞邐—－Ｉ逡逑＿邋１．０＿逡逑＞0

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2801565