【摘要】：單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是重要的人獸共患食源性病原菌,對(duì)人和多種動(dòng)物的健康威脅較大。LM能在多種毒力因子作用下,穿越宿主的腸道屏障、血胎屏障和血腦屏障,從而引起敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等疾病,死亡率高達(dá)30%。LPXTG基序表面蛋白在LM感染細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。Lmo0331蛋白是根據(jù)LM全基因組序列推測(cè)的LPXTG基序表面蛋白,但是其功能尚不清楚。本研究以綿羊李斯特菌病的腦組織分離株LM90SB2(血清型4b)為研究對(duì)象,首先對(duì)LM90SB2的lmo0331基因進(jìn)行序列分析及原核表達(dá);利用同源重組技術(shù)構(gòu)建LM90SB2的lmo0331基因缺失株,與親本株比較,對(duì)不同細(xì)胞粘附侵襲能力、小鼠的致病性、環(huán)境適應(yīng)性等生物學(xué)特性,初步探究lmo0331基因的功能。為進(jìn)一步研究LM的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1.LM90SB2 lmo0331基因分析和原核表達(dá)為了對(duì)單增李斯特菌臨床分離株LM90SB2的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因進(jìn)行克隆、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和原核表達(dá)。根據(jù)GenBank中收錄的lmo0331基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,利用PCR方法擴(kuò)增LM90SB2 lmo0331基因,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體,測(cè)序后進(jìn)行核苷酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)域分析;構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a-0331,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,利用SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)重組蛋白。結(jié)果顯示,LM90SB2 lmo0331基因核酸序列與NTSN株(4b型,綿羊腦,中國(guó)江蘇)、F2365株(4b型,奶酪,美國(guó))、LL195株(4b型,瑞士)及WSLC 1033株的同源性為100.0%,與N2306株(4b,李斯特菌病人的血液,瑞士)、02-1792株(4b,加拿大,奶酪)、H34株的同源性為99.9%。分離株LM90SB2的lmo0331基因全長(zhǎng)1956bp,ORF全長(zhǎng)為1857 bp,共編碼618個(gè)氨基酸;蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG結(jié)構(gòu)域。SDS-PAGE結(jié)果可見約88ku重組蛋白帶,Western blotting表明該蛋白可與小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。2.LM90SB2△lmo0331缺失株的構(gòu)建為了構(gòu)建LM90SB2△lmo0331缺失株,PCR擴(kuò)增LM90SB2 lmo0331基因的上下游臂,通過重疊PCR技術(shù)將lmo0331基因的上下游臂融合擴(kuò)增得到△lmo0331基因片段,將△lmo0331基因片段與自殺性質(zhì)粒pKSV7連接。將重組質(zhì)粒pKSV7-△lmo0331電轉(zhuǎn)化到LM90SB2感受態(tài)中,PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子置于含氯霉素的BHI培養(yǎng)基中41℃?zhèn)鞔囵B(yǎng),在雙重壓力下實(shí)現(xiàn)同源重組,旁側(cè)引物檢測(cè)重組情況。重組完全的菌株置于30℃無抗性培養(yǎng)基中連續(xù)傳代,丟失pKSV7穿梭質(zhì)粒,并檢測(cè)其穩(wěn)定性。通過PCR和測(cè)序結(jié)果顯示表明lmo0331基因編碼區(qū)被完全刪除,且缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。3.lmo0331基因缺失對(duì)LM90SB2體外環(huán)境耐受性影響為了探究lmo0331基因?qū)M環(huán)境適應(yīng)性的影響,比較了LM90SB2△lmo0331和LM90SB2在不同溫度、pH、滲透壓下生長(zhǎng)特性、生物被膜形成能力等差異。結(jié)果顯示:在4℃環(huán)境下,LM90SB△lmo0331缺失株的生長(zhǎng)速度顯著高于LM90SB2野毒株(P0.05);體外耐酸耐堿試驗(yàn)中,在堿性環(huán)境中(pH=9)LM90SB2△lmo0331缺失株生長(zhǎng)能力低于親本株LM90SB2(P0.05);在含4.5%乙醇的BHI培養(yǎng)基中,LM90SB2△lmo0331生長(zhǎng)趨勢(shì)顯著低于LM90SB2(P0.05),在含0.5%NaCl的BHI培養(yǎng)基中LM90SB2△lmo0331生長(zhǎng)趨勢(shì)顯著高于LM90SB2(P0.05)。提示Lmo0331蛋白對(duì)細(xì)菌的耐堿有重要作用。4.lmo0331基因缺失對(duì)LM90SB2毒力的影響為了探究lmo0331基因?qū)M毒力的影響,比較了LM90SB2△lmo0331與LM90SB2對(duì)不同細(xì)胞系的粘附侵襲能力和對(duì)小鼠毒力以及在小鼠肝臟、脾臟和腦中定植能力的差異。結(jié)果顯示:LM90SB2△lmo0331缺失株對(duì)多種細(xì)胞系的粘附侵襲能力有所下降。LM90SB2△lmo0331對(duì)RAW264.7、MBMEC、SIEC、HBMEC的粘附能力顯著下降(P0.05);LM90SB2△lmo0331對(duì)RAW264.7、MBMEC的侵襲能力顯著下降(P0.05)。小鼠感染試驗(yàn)顯示lmo0331基因缺失后LM90SB2的毒力下降,LM90△lmo0331與LM90SB2相比LD_(50)提高了0.97個(gè)數(shù)量級(jí)。在小鼠感染后不同時(shí)間點(diǎn),LM90SB2△lmo0331在肝臟和腦內(nèi)的載菌量均顯著低于LM90SB2,在脾臟中只有在48 h時(shí)顯著低于野毒株的載菌量。提示表面蛋白Lmo0331參與LM90SB2對(duì)小鼠的毒力。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

單增李斯特菌 Lmo0331 蛋白基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性研究果0331 基因 PCR 擴(kuò)增及克隆用特異特異性引物以 LM90SB2 的 DNA 為模板 PCR 擴(kuò)增出 lmo0檢測(cè)，所擴(kuò)增的目的 PCR 產(chǎn)物大小約 1956 bp 左右（圖 1-1）�？寺⌒跃海崛≈亟M質(zhì)粒 pMD19T-0331，經(jīng) BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶在約 1956 bp 出現(xiàn)目的條帶，在 2.6 kbp 出現(xiàn)一條長(zhǎng)的載體條帶，與-2）。M 1 2 3 4M 1 2

單增李斯特菌 Lmo0331 蛋白基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性研究果0331 基因 PCR 擴(kuò)增及克隆用特異特異性引物以 LM90SB2 的 DNA 為模板 PCR 擴(kuò)增出 lmo0檢測(cè)，所擴(kuò)增的目的 PCR 產(chǎn)物大小約 1956 bp 左右（圖 1-1）�？寺⌒跃海崛≈亟M質(zhì)粒 pMD19T-0331，經(jīng) BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶在約 1956 bp 出現(xiàn)目的條帶，在 2.6 kbp 出現(xiàn)一條長(zhǎng)的載體條帶，與-2）。M 1 2 3 4M 1 2

NTSN、F2365、WSLC 1003、LL195的相似性為100%，與N2306、02-1792、H34、SLCC2755相似性均為99%以上，與M7、08-5578的相似性分別為90.6%、90.7%，與標(biāo)準(zhǔn)株EGDe的相似性為88.7%（圖1-4）。同源性 Percent Identity (%)變異度Divergence(%)圖 1-4 不同菌株 lmo0331 氨基酸序列與參考菌株同源性比對(duì)分析Fig.1-4 Homology analysis of amino sequences of lm0331 in various strains圖 1-3 不同菌株 lmo0331 基因核苷酸序列與參考菌株同源性比對(duì)分析Fig.1-3 Homology analysis of nucleotide sequences of lm0331 gene in various strains同源性 Percent Identity (%)變異度Divergence(%)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2801191