【摘要】：人工授精(Artificial insemination,AI)技術(shù)是提高家畜繁殖效率的重要環(huán)節(jié),因此篩選獲得高質(zhì)量的凍精非常重要。然而,凍融過程導致精子品質(zhì)降低,繁殖力下降,影響了良種公牛種用價值,而且增加養(yǎng)殖成本。以往研究表明,細胞及生物體可通過合成熱應激蛋白HSPs來保護細胞免受外界傷害,且HSPs的表達水平與公畜的受精率密切相關(guān)。目前,尚無關(guān)于牦牛HSP70和HSP90與精子品質(zhì)相關(guān)性的報道。本研究以牦牛鮮精和凍融精子為試驗材料,經(jīng)45%Percoll單層梯度液純化后,通過檢測和分析牦牛精子質(zhì)量和精子內(nèi)酶活性差異,采用qRT-PCR、Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測HSP70和HSP90表達情況,并分析牦牛HSP70和HSP90表達量與精子質(zhì)量的相關(guān)性,為牦牛精子質(zhì)量和繁殖力的高低進行標記輔助評價提供科學依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.試劑盒(RNeasy Kit)、熱TRIzol和TRIzol一步法都可以獲得牦牛精子總RNA,但試劑盒提取的精子總RNA質(zhì)量(濃度、純度、完整性)優(yōu)于另外兩種方法(P0.05)。2.通過比較鮮精和凍精的精子活力、畸形率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率發(fā)現(xiàn),與鮮精相比,凍融后精子活力降低50.54%(P0.01),精子畸形率提高56.60%(P0.01),精子頂體完整率降低32.33%(P0.01),精子質(zhì)膜完整率降低51.28%(P0.01)。掃描電鏡結(jié)果顯示,鮮精的質(zhì)膜和頂體光滑且完整,而部分凍融精子質(zhì)膜和頂體受損。酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),凍融后精子內(nèi)GSH-PX、SOD、AST、ACP和LDH酶活極顯著低于鮮精(P0.01),與鮮精相比,分別降低67.65%、67.38%、61.58%、49.53%和47.06%。3.牦牛鮮精與凍精HSP70和HSP90表達差異比較研究中發(fā)現(xiàn),凍融精子HSP70和HSP90在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達量均顯著低于鮮精(P0.05)。鮮精HSP70蛋白主要在精子頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)、精子中段以及精子尾部表達,而凍精HSP70蛋白主要在精子后頂體區(qū)和精子中段表達且平均光密度值極顯著降低(P0.01)。鮮精和凍精中HSP90蛋白表達均在精子中段和尾部表達,凍融精子中段HSP90的熒光信號強度極顯著低于鮮精(P0.01),暗示蛋白定位與精子品質(zhì)有關(guān)。相關(guān)性分析可知,HSP70表達量與精子活力(r=0.753,P0.01)、質(zhì)膜完整率(r=0.656,P0.05)以及頂體完整率(r=0.632,P0.05)之間均存在顯著正相關(guān)。精子HSP90表達量與精子活力(r=0.723,P0.01)、質(zhì)膜完整率(r=0.586,P0.05)之間存在顯著正相關(guān),而HSP90表達量與頂體完整率(r=0.370,P0.05)之間存在正相關(guān)。綜上表明,凍融導致精子品質(zhì)、HSP70、HSP90表達量顯著降低,且HSP70、HSP90 mRNA表達量與精子品質(zhì)存在正相關(guān),可作為評價牦牛精子品質(zhì)的指標。
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S826
【圖文】：

19圖 1 精子純化結(jié)果Fig.1 The results of Sperm purification.：a，純化前結(jié)果；b，純化后結(jié)果。ote: a, Pre-purification results; b, Post- purification results.牛精子總 RNA 提取方法的比較本試驗前期對哺乳動物精子總RNA的提取方法進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)試劑盒（RNeasRIzol 和 TRIzol 一步法是近年來常用的 3 種精子總 RNA 提取方法。因此本研究上述 3 種方法提取牦牛冷凍精子總 RNA，并分別檢測其濃度和純度以及CR 檢測總 RNA 質(zhì)量，最終從中篩選適合牦牛精子總 RNA 提取的方法。精子總 RNA 濃度和純度檢測由表 3 可知，試劑盒提取牦牛冷凍精子總 RNA 的 OD260/280為 1.89 ±0.15 顯著

圖 2 GAPDH 和 β-actin 基因擴增電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherogram after amplification of the GAPDH and β-actin genes.注：G1～G3，GAPDH 基因擴增產(chǎn)物；A1～A3，β-actin 基因擴增產(chǎn)物.Ⅰ，試劑盒法；Ⅱ，熱 TRIzol 法；Ⅲ，TRIzol 一步法。下同Note: G1～G3, PCR product of GAPDH; A1～A3, PCR product of β-actin.Ⅰ, The kit; Ⅱ, Hot-TRIzol; Ⅲ, One-step TRIzol. The same as follows.3 種方法提取的牦牛冷凍精子總 RNA 樣品針對成熟精子細胞內(nèi)表達的基因 SRY、RPS23 通過 RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，試劑盒提取的 RNA 擴增出 SRY（150 bp）、RPS23（19bp）基因條帶；熱 TRIzol 和 TRIzol 一步法均只出現(xiàn) SRY 基因條帶（見圖 3）。說明試劑盒提取精子總 RNA 的質(zhì)量優(yōu)于另外兩種方法。

圖 2 GAPDH 和 β-actin 基因擴增電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherogram after amplification of the GAPDH and β-actin genes.注：G1～G3，GAPDH 基因擴增產(chǎn)物；A1～A3，β-actin 基因擴增產(chǎn)物.Ⅰ，試劑盒法；Ⅱ，熱 TRIzol 法；Ⅲ，TRIzol 一步法。下同Note: G1～G3, PCR product of GAPDH; A1～A3, PCR product of β-actin.Ⅰ, The kit; Ⅱ, Hot-TRIzol; Ⅲ, One-step TRIzol. The same as follows.3 種方法提取的牦牛冷凍精子總 RNA 樣品針對成熟精子細胞內(nèi)表達的基因 SRY、RPS23 通過 RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，試劑盒提取的 RNA 擴增出 SRY（150 bp）、RPS23（19bp）基因條帶；熱 TRIzol 和 TRIzol 一步法均只出現(xiàn) SRY 基因條帶（見圖 3）。說明試劑盒提取精子總 RNA 的質(zhì)量優(yōu)于另外兩種方法。

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本文編號：2799228