【摘要】：胞外囊泡(Outer membrane?vesicles,OMVs)是細(xì)菌在生長過程中從細(xì)胞膜向細(xì)胞外空間分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的納米級囊泡體。它含有細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白、脂質(zhì)和核酸等多種生物活性分子,在細(xì)胞間傳遞信號,具有多種生理功能,如:介導(dǎo)細(xì)菌-宿主間的相互作用、呈遞細(xì)菌抗原、調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)功能等。隨著對OMVs生物學(xué)特性和功能的研究不斷深入,OMVs作為細(xì)菌抗原載體的潛力及對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用已引起學(xué)界的廣泛關(guān)注。本試驗以納米級的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium,ST)胞外囊泡(ST-OMVs)作為免疫佐劑,探究其對肉仔雞生長性能、血清免疫指標(biāo)以及對抗ST感染能力的影響,為新型疫苗防控雞沙門氏桿菌疾病奠定基礎(chǔ)。試驗一沙門氏菌胞外囊泡的分離鑒定與生物特性分析鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)過無菌環(huán)境下的純化、培養(yǎng),采用差速離心法從ST培養(yǎng)液上清中富集ST-OMVs,隨后采用密度梯度離心法進(jìn)行純化得到純化ST-OMVs。(1)掃描電鏡檢測ST-OMVs,結(jié)果顯示:ST-OMVs的形態(tài)大小不一,無雜質(zhì)視野清晰,平均直徑為100 nm左右,符合細(xì)菌胞外囊泡的顆粒粒徑要求。(2)采用激光納米粒度分析儀檢測所獲得純化ST-OMVs的粒徑分布,結(jié)果顯示MODE粒徑的峰值為76 nm,其曲線平緩流利,說明含有的雜質(zhì)較少,純度較好。MODE粒徑與細(xì)菌OMVs的理論顆粒粒徑值基本吻合,偏離的小部分可能與顆粒之間的粘著程度有關(guān)。(3)采用BCA法檢測ST-OMVs的蛋白含量,結(jié)果表明1×10~100 particles/mL的ST-OMVs的蛋白含量為7.3μg/mL。試驗二沙門氏菌胞外囊泡對肉仔雞生產(chǎn)性能及預(yù)防沙門氏菌感染的效果研究350只1日齡健康愛拔益加雛雞清潔環(huán)境中飼養(yǎng)至7日齡,選擇沙門氏菌感染為陰性、健康、體重差異不顯著的雛雞320只隨機(jī)等分為5組,每組8重復(fù),每重復(fù)8只。試驗設(shè)計為未感染的對照組(PBS組)、沙門氏桿菌感染組(ST組,攻毒試驗用)和3個不同OMVs免疫劑量免疫組,分別注射5、10和20μg/d/只的OMVs(OMV5、OMV10和OMV20),試驗期日糧和常規(guī)飼養(yǎng)管理按本品種飼養(yǎng)指南進(jìn)行。雛雞分別在8-10、15-17、22-24日齡3次、每次連續(xù)3天、每天1次性對3個OMVs免疫組雛雞腹腔分別注射設(shè)計劑量的OMVs;同時,PBS組和ST組雛雞分別注射等容量的PBS溶液。試驗雞30日齡時,對ST組和3個OMVs免疫組雞腹腔1次性注射0.5 mL的1×10~9 CFU/m L的ST進(jìn)行攻毒,PBS組雞注射等容量的PBS溶液,飼養(yǎng)5天后觀測雞群健康變化;試雞50日齡時,對前期試驗健康觀測最佳免疫OMV10組雞腹腔1次性注射0.5 mL的5×10~9 CFU/mL的ST進(jìn)行攻毒,飼養(yǎng)觀察5天。結(jié)果表明:(1)OMVs對肉仔雞生產(chǎn)性能和免疫功能影響試驗與PBS對照組相比,OMV5和OMV10組的試驗雞日均采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率均無顯著差異(P0.05),而OMV20組的試驗雞日均采食量和平均日增重顯著降低(P0.05)、飼料轉(zhuǎn)化率顯著增加(P0.05);3個OMVs免疫組試驗雞的死亡率及免疫器官指數(shù)與PBS組均無顯著差異(P0.05);OMVs免疫可顯著提高肉仔雞血清溶菌酶活力、白蛋白含量、C3含量及SOD活力(P0.05)。(2)OMVs對肉仔雞ST攻毒后的免疫保護(hù)試驗試期30日齡雛雞對ST組和3個OMVs免疫組同劑量ST攻毒后觀測5天發(fā)現(xiàn),與ST組比較,3個OMVs免疫組雞攻毒后均能夠消除ST感染引起的試驗雞體重下降(P0.05),顯著提高(P0.05)ST感染試驗雞的存活率,尤以O(shè)MV10和OMV20免疫組效果最好。此外,10μg/d/只的OMVs免疫可顯著降低ST感染后血液中的IL-1β和TNF-α的含量(P0.05),且有降低IL-6含量的趨勢(P=0.074)。試驗第50天對PBS組和OMV10組攻毒后觀測5天,兩組雞的存活率無顯著差異(P0.05),說明OMVs對肉仔雞的免疫持久性良好。試驗結(jié)論:(1)利用差速離心和密度梯度離心相結(jié)合的方式能獲得純化程度較高的OMVs;利用掃描電鏡觀察與Nanosight顆粒粒徑分析相結(jié)合方法鑒定OMVs形態(tài),準(zhǔn)確性好。(2)OMVs具有增強(qiáng)肉仔雞免疫的功效,主要表現(xiàn)在能提高肉仔雞血清溶菌酶和SOD活力、以及白蛋白和C3含量;能夠消除ST感染引起的肉仔雞體重下降,提高ST感染后肉仔雞存活率;OMVs對肉仔雞抵抗ST感染的能力具有良好持久性。(3)OMVs增強(qiáng)肉仔雞免疫具有明顯的劑量效應(yīng)。較大劑量(如20μg/d/只)會對肉仔雞生產(chǎn)性能、甚或成活率造成負(fù)面影響;適度劑量則沒有此效應(yīng)。本試驗中,10μg/d/只的免疫劑量為最佳免疫劑量。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.31
【圖文】：

.1.2 細(xì)菌胞外囊泡的形態(tài)特征對最初富集的細(xì)菌胞外囊泡的物理特性的初步表征很重要，據(jù)此能確定它們的，如尺寸、形態(tài)、產(chǎn)量、濃度和成分。但這需要用一套分析技術(shù)來完成（Jain and P7），包括電子顯微鏡（Electron microscopy, EM），免疫印記（Western blotting白質(zhì)（Total protein）的估計和單個粒子的跟蹤（Individual particle tracking）等。了關(guān)于囊泡的結(jié)構(gòu)形態(tài)、完整性和亮度的合理定性信息；總量蛋白質(zhì)的數(shù)量，計從培養(yǎng)基中獲得細(xì)菌胞外囊泡產(chǎn)量的黃金標(biāo)準(zhǔn)；納米粒子跟蹤分析（Nanopacking analysis, NTA）等方法對單個粒子進(jìn)行形態(tài)分析，所有這些都有助于確定它和大小。在透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, TEM）下可以菌胞外囊泡是直徑在 50-200 nm 間的球狀結(jié)構(gòu)，是一種定性的視覺比較，具體 所示，是在 TEM 下觀察到不同分離法得到的的恥垢分枝桿菌（Mycobacteegmatis）胞外囊泡的的形態(tài)結(jié)構(gòu)（Jain and Pillai 2017）。圖 1-2 提供了一個典A 對細(xì)菌胞外囊泡的描述結(jié)果，包括懸掛的細(xì)菌胞外囊泡的視覺圖像和每個大小布的量化結(jié)果。通過不同的方法獲得細(xì)菌胞外囊泡的大小濃度，再結(jié)合其組成成更全面的了解其功能特性以便為后續(xù)研究提供科學(xué)的依據(jù)。

圖 1-2 NTA 法觀測細(xì)菌胞外囊泡Fig. 1-2 Observation of bacterial extracellular vesicles by NTA(Jain and Pillai 2017)1.2.1.3 細(xì)菌胞外囊泡的功能現(xiàn)在對囊泡的機(jī)械原理和功能已有一定的了解，但是它的生物源和調(diào)控原理還是不完整的，它們在細(xì)胞間通訊、基因轉(zhuǎn)移、毒性因子的運輸、抗原和毒素以及疾病發(fā)病機(jī)理等方面的作用已多有研究成果（Remis et al. 2014; Yaron et al. 2000）。（1）細(xì)菌胞外囊泡的生理功能細(xì)菌的基因型和包膜結(jié)構(gòu)的多樣性解釋了膜囊泡功能的多樣性。通常，細(xì)菌利用這些小囊泡來提高它們在環(huán)境中生存的機(jī)會。細(xì)菌胞外囊泡與支持細(xì)菌生存的許多功能有關(guān)，包括生物膜的形成，種內(nèi)基因和營養(yǎng)的轉(zhuǎn)移，生態(tài)防御和細(xì)胞間通信。例如，從假單胞菌 PAO1（p.aeruginosa, PAO1）中釋放的細(xì)菌胞外囊泡能夠裂解與自身競爭的細(xì)菌如：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大腸桿菌（E. coli）和假單胞菌 8803（Pseudomonas 8803）（Kadurugamuwa and Beveridge 1996）。來自牙齦卟啉單胞菌（Pgingivalis）的囊泡通過轉(zhuǎn)運 PPAD 酶到宿主抑制了補體因子 C5a 從而增強(qiáng)了宿主的免疫系統(tǒng)（Bielecka et al. 2011）。這些報道很好地說明了細(xì)菌胞外囊泡在促進(jìn)母細(xì)菌存活方

來自各種病原菌的細(xì)菌胞外囊泡與上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用從而（Cytokines）、趨化因子（Chemokines）和抗菌肽（Antimicrobial peptide通過激活或者抑制它們的細(xì)胞對這些疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)。KaparakisLiaskos 和5）對細(xì)菌胞外囊泡對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。這些囊種毒性因子，如堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase）、溶血性磷脂酶 C（Hholipase C）和膽囊纖維調(diào)控因子（Cystic fbrosis transmembrane regulator, 子（Inhibitory factor, Cif），從而影響宿主細(xì)胞生物學(xué)（Bomberger et al. 它們還會引發(fā)免疫調(diào)節(jié)活動，在針對腦膜（N. meningitidis）疫苗的生產(chǎn)中用了（Durand et al. 2009b）。抗原可以在細(xì)菌胞外囊泡表面顯示，從而在烈的炎癥和免疫反應(yīng)。例如，Alaniz 等（2007）的研究表明：鼠傷寒沙門外囊泡可以刺激促炎因子的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis fact）和白介素-2（Interleukin-2, IL-2）而且 CD4+T 細(xì)胞被激活�？傊�，這些菌胞外囊泡在疾病發(fā)病機(jī)理中的廣泛作用。圖 1-3 總結(jié)了細(xì)菌胞外囊泡的能。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2798541