【摘要】：近年來,由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株導(dǎo)致的豬流行性腹瀉(PED)大規(guī)模暴發(fā),給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失,引起各國學(xué)者的高度重視。PEDV快速檢測及其致病機(jī)理的研究就顯得尤為重要。本研究首先制備了PEDV單克隆抗體,建立了腸道組織PEDV快速檢測方法,為臨床PED診斷以及致病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。開展了以i TRAQ為基礎(chǔ)的PEDV強(qiáng)弱毒株感染Vero細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,獲得PEDV強(qiáng)弱毒株感染Vero細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜,為解析不同毒力PEDV毒株的致病機(jī)制提供參考。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基礎(chǔ)上,探究了細(xì)胞自噬在PEDV復(fù)制過程中的作用,為新型抗病毒策略的制定提供基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:1.PEDV單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性分析利用原核表達(dá)的PEDV S1D蛋白,制備了3株抗PEDV的單克隆抗體。三株單抗效價(jià)均在1:10~6以上,且均為Ig G 2a亞型κ輕鏈。IFA和Western Blot試驗(yàn)表明,該抗體可以與桿狀病毒表達(dá)的S1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),能夠特異性識(shí)別PEDV病毒粒子,與另外兩種常見腸道病毒TGEV、RV不發(fā)生交叉反應(yīng)。此外,該單抗還可以用于PEDV感染仔豬腸道免疫組織化學(xué)分析。2.PEDV快速檢測方法的建立在本試驗(yàn)獲得單克隆抗體的基礎(chǔ)上,借助冰凍切片技術(shù),建立了一種用于臨床腸道樣品PEDV快速檢測的IFA方法。該方法與HE染色分析相結(jié)合,不僅可以特異性檢測腸道PEDV感染,還可以直觀病變部位損傷情況。將102份臨床送檢仔豬腸道分別進(jìn)行IFA和RT-PCR檢測,兩者PEDV檢出率分別為97%和92%,總符合率為91.2%,表明該方法可以用于臨床PEDV快速檢測。3.PEDV強(qiáng)弱毒株感染Vero細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析本研究運(yùn)用i TRAQ串聯(lián)LC-MS/MS技術(shù),開展了PEDV強(qiáng)弱毒株感染Vero細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在PEDV強(qiáng)毒株CH/YNKM-8/2013和CV777樣疫苗毒株AH-M感染組分別鑒定到661個(gè)和474個(gè)差異表達(dá)的蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要聚焦于蛋白質(zhì)合成、免疫調(diào)控、細(xì)胞組裝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及凋亡等方面。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),較弱毒株而言,PEDV強(qiáng)毒株顯著上調(diào)NF-κB通路,誘發(fā)更強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。此外,PEDV強(qiáng)毒株通過下調(diào)m TOR及其下游靶分子4EBP1和p70S6K,以及e IF2(真核起始因子)通路活性來抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。4.PEDV感染Vero細(xì)胞誘導(dǎo)完全細(xì)胞自噬PEDV感染Vero細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),多個(gè)自噬相關(guān)蛋白在PEDV感染過程中顯著上調(diào),同時(shí)自噬相關(guān)通路m TOR顯著下調(diào),這提示細(xì)胞自噬可能與PEDV在Vero細(xì)胞上的增殖有關(guān)。透射電子顯微鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn),PEDV感染的Vero細(xì)胞中自噬樣雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)增多。激光共聚焦顯微鏡分析表明,PEDV感染導(dǎo)致GFP-LC3的點(diǎn)狀積累,同時(shí)免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)量顯著增加。這表明PEDV感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。UV滅活試驗(yàn)進(jìn)一步證明細(xì)胞自噬的激活與PEDV的有效復(fù)制有關(guān)。為了探究PEDV感染能否誘導(dǎo)自噬潮,我們檢測了p62的降解、m RFP-GFP-LC3的共定位,以及加入溶酶體抑制劑后p62和LC3 II含量的變化,結(jié)果表明PEDV感染可以誘導(dǎo)完全細(xì)胞自噬。5.細(xì)胞自噬促進(jìn)PEDV增殖為了探究細(xì)胞自噬在PEDV增殖過程中的具體作用,我們分別利用自噬抑制劑(3-MA或CQ)和誘導(dǎo)劑(rapamycin)處理Vero細(xì)胞,觀察PEDV的增殖情況。發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞自噬后,PEDV的病毒滴度降低,而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后,PEDV病毒滴度升高。將自噬關(guān)鍵基因Beclin1和ATG5沉默之后,PEDV病毒滴度降低。這進(jìn)一步說明細(xì)胞自噬可以促進(jìn)PEDV增殖。6.細(xì)胞自噬與NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)存在正調(diào)控關(guān)系為了探究細(xì)胞自噬在PEDV介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)自噬關(guān)鍵基因ATG5和Beclin1沉默之后,PEDV誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)顯著下調(diào)。這提示,細(xì)胞自噬可能參與PEDV介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞自噬受到抑制時(shí),NF-κB信號(hào)通路活性降低。同樣地,當(dāng)NF-κB活性受到抑制時(shí),PEDV誘導(dǎo)LC3 II的含量也顯著降低。這表明細(xì)胞自噬可能與PEDV誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路存在正調(diào)控關(guān)系。為了排除上述過程中PEDV不同增殖滴度對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響,我們用TNF-α處理自噬抑制后的Vero細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)TNF-α介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)量下調(diào)。這進(jìn)一步說明了PEDV感染Vero細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與PEDV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)存在正調(diào)控關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

病毒粒子呈皇冠狀，因此稱為冠狀病毒。PEDV 在 4℃、pH5.0~9.0 條件下，或者 37℃、pH6.5~7.5 條件下都能穩(wěn)定存活，但 PEDV 對(duì)外界環(huán)境的抵抗力并不強(qiáng)，60℃的環(huán)境中，30 min 以上病毒就會(huì)失去感染活力。本病毒對(duì)乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑敏感，酸性或堿性的殺毒劑也可以很快殺死病毒，與其他 α-冠狀病毒一樣，PEDV 沒有凝血活性（Song and Park 2012）。1.1.5 PEDV 基因結(jié)構(gòu)PEDV 是有囊膜的、線性、單股正鏈 RNA 病毒 （Song and Park 2012），基因組全長約 28kb。PEDV 基因組結(jié)構(gòu)如圖 1-1 所示，在 5 帽子結(jié)構(gòu)與 3 poly A 尾巴之間，基因組 RNA 包含 7 個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs）（Kocherhanset al 2001）。最大的兩個(gè) ORFs（ORF1a 和 ORF1b）位于 5’ UTR 下游 2/3 基因組，編碼病毒復(fù)制相關(guān)聚合酶類。另外 1/3 基因組編碼 4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M、N）和 1 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF3）（Duarte et al 1993）。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文弱毒株感染組分別鑒定到 269 和 301 個(gè)差異表達(dá)的蛋白（Li et al 2016b）。運(yùn)用iTRAQ 技術(shù)，Huang 等發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)型 T 細(xì)胞（Treg）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，為闡述 Treg 細(xì)胞在獲得性免疫反應(yīng)中的作用提供了新的視角（Huang et al2010）。

iTRAQ試劑結(jié)構(gòu)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳金東;;細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡在細(xì)胞中的作用[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年03期

2 尹穩(wěn);伏旭;李平;;蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2014年01期

3 向敏;張潔;高其雙;盧順;陳志華;黃海軍;陶弼菲;彭霞;占才耀;夏瑜;童偉文;華娟;王連芳;;豬流行性腹瀉病毒COE核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年11期

4 劉隨新;石達(dá);陳建飛;張鑫;時(shí)洪艷;劉孝珍;張莎;王璐;馮力;;豬流行性腹瀉病毒N蛋白核仁定位信號(hào)對(duì)宿主細(xì)胞周期的影響[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年03期

5 劉云波;趙洪翠;王志成;武剛;何啟蓋;;豬病毒性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年02期

6 張坤;何啟蓋;;豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年08期

7 葛俊偉;姜艷平;汪淼;喬薪瑗;劉敏;唐麗杰;李一經(jīng);;表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點(diǎn)的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2010年07期

8 佟有恩,馮力,李偉杰,朱遠(yuǎn)茂,王明,馬思奇;豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);1999年06期

9 佟有恩,馮力,李偉杰,王明,馬思奇;豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J];中國畜禽傳染病;1998年06期

10 馬思奇,王明,馮力,李偉杰;豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)氫氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗的研究[J];中國畜禽傳染病;1995年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳全剛;PRRSV感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 王玄珂;豬流行性腹瀉病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 徐麗麗;豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 孟凡丹;豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2797812