【摘要】：遼寧絨山羊在絨毛品質和產(chǎn)絨量方面,居世界同類品種前列,所產(chǎn)羊絨屬于稀有的特種動物纖維,是一種珍貴的紡織原料。近日國家統(tǒng)計局發(fā)布的國內羊絨及山羊數(shù)據(jù)顯示,國內原絨產(chǎn)量自2014年開始逐年下降,且跌幅較大,自產(chǎn)的羊絨原料遠遠滿足不了本土企業(yè)和外商投資企業(yè)的生產(chǎn)和出口需要。而毛囊作為被毛生長發(fā)育的重要部位,無論在胚胎期還是出生后,均具有自我更新和周期性生長的特點,且整個過程多基因參與。因此,通過對調控毛囊發(fā)育周期機理的研究來改善和提高羊絨的品質和產(chǎn)量成為近年來的研究目標。miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的內源性的單鏈非編碼小RNA,通過與靶基因mRNA的非編碼區(qū)的結合抑制其翻譯或引起降解,從而參與生物體的生物學過程。近年來研究團隊對絨山羊和細毛羊毛囊周期發(fā)育中的miRNA開展了系統(tǒng)的研究,通過高通量測序手段,發(fā)現(xiàn)作為上皮組織特異性表達的miRNA-203,參與絨山羊和細毛羊毛囊的發(fā)育,但其如何在毛囊周期發(fā)育中起調控作用的未見相關報道。因此,miRNA-203被選為本實驗的研究目標。利用miRBase、microRNA.org、TargetScanHuman7.1和microRNA target prediction等在線生物學軟件預測miRNA-203的靶基因,并篩選出與毛囊發(fā)育相關的靶基因,在mRNA水平、蛋白水平和細胞水平上,驗證miRNA-203和候選靶基因在絨山羊毛囊周期發(fā)育中的表達差異,明確miRNA-203與靶基因的結合位點,闡明miRNA-203對絨山羊毛囊發(fā)育周期的調控機理,完善miRNA在毛囊發(fā)育周期中的作用,為,提高和改善絨山羊羊絨產(chǎn)量和毛品質提供了新的思路。具體研究結果如下:1.利用在線生物信息學軟件miRBase、microRNA.org、TargetScanHuman7.1和microRNA target prediction等預測miRNA-203的靶基因,并篩選出與毛囊發(fā)育相關的靶基因:DDOST、NAE1和GLYATL2。2.同源性分析,對DDOST、NAE1和GLYATL2測序表明與綿羊、牛等物種的同源性高達95%以上,說明靶基因序列具有遺傳保守性。3.在mRNA水平上,對miRNA-203及DDOST、NAE1和GLYATL2進行鑒定發(fā)現(xiàn),miRNA-203在絨山羊毛囊發(fā)育的生長期和休止期均有表達,且在休止期的表達量顯著高于生長期;候選靶基因的表達則相反。-4.對靶基因DDOST和NAE1進行蛋白鑒定,結果表明,DDOST和NAE1在絨山羊生長期中表達上調,結果與熒光定量結果一致。體內實驗的結果初步表明miRNA-203通過DDOST和NAE1參與絨山羊毛囊周期發(fā)育。5.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)鑒定miRNA-203與靶基因DDOST和NAE1的特異性結合位點表明,在DDOST和NAE1的3’UTR上存在miRNA-203的靶位點—GAACCAC、GGCGTCC。6.通過體外實驗,對細胞進行轉染,在mRNA水平和蛋白水平上,對過表達miRNA-203后的miRNA-203及DDOST和NAE1進行驗證,結果表明,miRNA-203在mimics組的表達量明顯高于陰性對照組,而靶基因的表達則相反,miRNA-203顯著下調DDOST和NAE1的表達。綜上,miRNA-203通過負調控靶基因(DDOST和NAE1)參與毛囊周期發(fā)育,可作為一種進一步選育優(yōu)質羊品種的方法手段。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S827.2
【圖文】：

要的附屬可再生器官，是毛纖維的 發(fā)源地質細胞各成分相互作用的復雜的生物學過程[1、皮脂腺（SG）、隆突部（Bu）和毛球（HB）質、毛皮質和毛小皮組成[4]，內根鞘（IRS）和的形成是毛囊形態(tài)發(fā)生最重要的一步，這也外根鞘位于內根鞘的外層，被結締組織鞘包裹號通路直接或間接影響毛干的生長發(fā)育[5]，毛干是上皮細胞和毛母質細胞受真皮乳頭傳毛根和毛干的形成提供營養(yǎng)物質，毛球包圍lla cells, DPCs)是位于毛囊基底部的真皮源性主導作用，被視為毛囊發(fā)育調控中樞[9]。引乳頭細胞結構或功能異常，已成為研究毛囊

濃度(ng/μl) OD260/230OD260/280休止期 濃度(ng/μl) OD260/230O452.76 1.847 2.015 1 513.16 1.577 2.583.00 1.584 1.963 2 475.88 1.578 2.717.09 1.772 1.979 3 511.92 1.592 1.401.24 1.849 2.003 4 410.64 1.628 1.517.00 1.576 1.986 5 350.44 1.713 1.538.68 1.645 2.008 6 556.92 1.517 2.定量 PCR 檢測 miRNA-203 在生長期和休止期絨山羊皮膚組織中驗利用熒光定量PCR試劑盒檢測miRNA-203在絨山羊生長期和休平。并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果表明：miRNA-203 在絨山羊期的皮膚組織中均有表達，且在休止期的表達量高于生長期，差異.1，**P<0.01）。

miRNA-203NXPH4、B3GNT5、CNTNAP2、NOX4、LRTOMT、Wnt4、SLC7a6os、AKTN1、NAE1、JPH3、CCDC7、ITGA2、HSPB8、FOXP1 、 ATG12 、 DDOST 、 BAT2 、CD8B、GLYATL2、ILRB2、MANBAL、P2RX73.2 靶基因序列分析3.2.1 靶基因測序結果靶基因 PCR 的產(chǎn)物送庫美生物公司進行測序。測序結果如圖 2.1 所示：去除前幾個不穩(wěn)定的堿基外，峰值表現(xiàn)單一，送檢樣品純度較高。同時結果也顯示，GLYATL2、DDOST 和 NAE1 片段大小分別為 204 bp、270 bp、176 bp，與設計的片段大小基本一致，表明測序正確。

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本文編號：2793628