【摘要】：豬丁型冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一種新發(fā)現(xiàn)的豬腸道病毒,可引起以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬死亡為特征的腸道疾病。2012年,PDCoV首次在我國香港被發(fā)現(xiàn),隨后該病于2014年在美國爆發(fā)。目前PDCoV在世界許多國家都被檢測到,據(jù)報道,在我國的部分省份豬場中也檢測到了PDCoV,該病毒已經(jīng)成為嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的新發(fā)病原。本研究將RT-PCR檢測為PDCoV陽性的腹瀉樣本接種ST細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離傳代。通過觀察其細(xì)胞病變,RT-PCR、病毒滴度的測定和間接免疫熒光的鑒定,結(jié)果成功分離到1株能在ST細(xì)胞上穩(wěn)定增殖并能產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(CPE)的豬丁型冠狀病毒(HB-BD毒株)。通過RT-PCR對其全基因進(jìn)行了擴(kuò)增,除去3’端poly(A),基因組全長為25420 bp,基因結(jié)構(gòu)為5’UTR-ORF1-S-E-M-NSP6-N-NSP7-3’UTR,每部分的堿基數(shù)分別為540 nt,18803 nt,3480 nt,252 nt,654 nt,285 nt,1029 nt,603nt和392 nt。全基因序列分析顯示,HB-BD株與參考株之間的同源性為97.2%-99.5%,并與PDCoV/NH株之間的同源性最高(99.5%);進(jìn)化樹分析表明,HB-BD株與其他PDCoV參考株同屬于δ冠狀病毒屬,并且與中國毒株的親緣關(guān)系比美國、韓國和泰國毒株近。以純化的重組PDCoV S1蛋白作為包被抗原,通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后,建立了檢測豬血清中PDCoV IgG抗體的間接ELISA方法。優(yōu)化結(jié)果顯示,該方法的抗原最佳包被濃度為1.0μg/mL,血清稀釋倍數(shù)為1∶200,封閉液為含5%胎牛血清的PBST工作液。酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶20000。一抗和二抗的孵育時間均為37℃作用1 h;底物顯色時間為15 min。通過30份陰性血清,得出陰陽性臨界值為0.369。特異性試驗(yàn)表明,該方法不與PEDV、TGEV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV等常見豬病毒陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng);重復(fù)性試驗(yàn)表明,批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)都小于10%,具有較好的特異性和重復(fù)性。ROC曲線分析得出,與western blot相比,該方法的敏感性和特異性分別為100%和92.3%。上述試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立的重組S1蛋白間接ELISA方法具備檢測PDCoV抗體的可行性。應(yīng)用建立的間接ELISA方法,對2017年1月至2017年12月份收集的來自河北部分地區(qū)的542份豬血清樣品進(jìn)行檢測,樣本陽性率為18.6%。鑒于目前尚無有效的治療方法或疫苗可用于控制PDCoV。本研究為探討依靠RNA干擾(RNAi)技術(shù)對PDCo V體外增殖的抑制作用,分別構(gòu)建了針對PDCoV的M和N基因的兩個shRNA表達(dá)質(zhì)粒(p Genesil-M和pGenesil-N),并轉(zhuǎn)染入ST細(xì)胞,進(jìn)行基因干擾實(shí)驗(yàn)研究。分別對轉(zhuǎn)染組和對照組進(jìn)行TCID_(50)檢測,以及對CPE進(jìn)行觀察和熒光定量PCR檢測,測定結(jié)果表明兩種shRNA表達(dá)質(zhì)粒(pGenesil-M和pGenesil-N)均能夠抑制PDCoV在ST細(xì)胞上的增殖,且pGenesil-N表達(dá)質(zhì)粒的抑制率要高于pGenesil-M表達(dá)質(zhì)粒。綜上所述,本研究對PDCoV HB-BD毒株進(jìn)行了分離鑒定以及全基因序列分析,并根據(jù)S1蛋白建立了間接ELISA方法,對2017年河北省部分地區(qū)的血清樣本進(jìn)行了檢測,以及對RNAi技術(shù)抑制PDCoV體外增殖進(jìn)行了研究。本研究為PDCoV的遺傳進(jìn)化、致病性等研究奠定了基礎(chǔ),也在流行病學(xué)調(diào)查、疾病的診斷、疫苗的研制和防治工作方面具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

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本文編號：2793509