【摘要】：豬肺炎支原體引起豬喘氣病,并經(jīng)常與其它病原混合感染。豬肺炎支原體感染后,會破壞氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞,引起炎癥反應(yīng)和組織壞死。支原體沒有合成核酸基礎(chǔ)物質(zhì)的能力,主要通過分泌核酸酶來降解外源性核酸物質(zhì)來為其生長和代謝提供核酸。另外,支原體核酸酶還能夠降解中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱(NETs),促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。因此,核酸酶在豬肺炎支原體感染過程中發(fā)揮著重要作用。豬肺炎支原體具有三種核酸酶,即Mhp109、Mhp379和Mhp597。我們通過TGA定點突變后,成功地原核表達(dá)并純化了這三種核酸酶。1μg rMhp597蛋白在15 s內(nèi)即可將1μg核酸底物徹底降解,說明rMhp597對雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、質(zhì)粒DNA和RNA這幾種核酸物質(zhì)具有極強(qiáng)的降解作用。并經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn),rMhp597酶活性溫度范圍是17℃-57℃,且具有Ca2+和Mg2+依賴性,C端315-377強(qiáng)堿性極性區(qū)是rMhp597的酶活性區(qū)。rMhp109和rMhp379的核酸降解活性較弱,活性溫度范圍為17℃-47℃。中性粒細(xì)胞通過分泌以DNA物質(zhì)為骨架的NETs來捕獲致病微生物,致病微生物也能夠通過分泌核酸酶降解NETs來逃避中性粒細(xì)胞捕獲。我們研究發(fā)現(xiàn),rMhp597、rMhpl09和rMhp379均可有效降解NETs,其中rMhp597的作用最強(qiáng)。豬肺炎支原體培養(yǎng)上清也可有效降解NETs,且能被rMhp597多克隆抗體阻斷,證實豬肺炎支原體分泌在上清中的Mhp597的核酸降解活性。采用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),三種重組核酸酶分別降解NETs后,豬肺炎支原體含量均顯著高于NETs未降解對照組,說明這三種重組核酸酶通過降解NETs可促進(jìn)豬肺炎支原體逃避中性粒細(xì)胞的誘捕。通過間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)rMhp109、rMhp379和rMhp597可粘附在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)的細(xì)胞膜上,也可對PK15細(xì)胞引起劑灄相關(guān)性的細(xì)胞凋亡,降低PK15細(xì)胞的活力。通過siRNA干擾或 TAK-242、ST2825、Bay11-7082 抑制 TLR4、MyD88 及 NF-κB 發(fā)現(xiàn),rMhp597 可通過 TLR4、MyD88、NF-κB信號通路上調(diào)PAMs IL-]β、IL-8和TNF-α的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),rMhp597的N端跨膜區(qū)和C端強(qiáng)堿性極性區(qū)的缺失不會影響rMhp597黏附PAMs、產(chǎn)生細(xì)胞毒性以及上調(diào)促炎細(xì)胞因子的活性。另外,rMhp597還可下調(diào)PAMsIFN-α/β的表達(dá),并促進(jìn)PAMs內(nèi)PRRSV的復(fù)制,但rMhp109、rMhp379沒有這種作用,三種重組核酸酶也均不能促進(jìn)PAMs內(nèi)PCV-2的復(fù)制。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),在rMhp597下調(diào)PAMs IFN-α/β的過程中,TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和IRF3被顯著抑制,由此推測rMhp597可能通過抑制TLR3/TLR7/TLR8/TLR9-IRF3信號通路抑制IFN-α/β的表達(dá)。通過截短蛋白研究發(fā)現(xiàn),rMhp597δTM和rMhp597δ315.377均可下調(diào)IFN-α/β的表達(dá)及促進(jìn)PAMs內(nèi)PRRSV的復(fù)制,說明N端跨膜區(qū)和C端強(qiáng)堿性極性區(qū)的缺失不會影響rMhp597蛋白的免疫抑制活性。綜上所述,rMhp597、rMhp109、rMhp379均具有核酸酶活性、細(xì)胞黏附性和細(xì)胞毒性,能夠破壞NETs以幫助豬肺炎支原體逃避中性粒細(xì)胞捕獲。rMhp597的核酸降解作用極強(qiáng),可顯著上調(diào)促炎細(xì)胞因子、下調(diào)IFN-α/β的表達(dá)、促進(jìn)PAMs內(nèi)PRRSV的復(fù)制,是豬肺炎支原體的一種重要毒力蛋白。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28
【圖文】：

邋：逡逑ｓ邋１邋：逡逑圖２－３邋Ｍｈｐ３７９基因定點突變逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｍｈｐ３７９邋ｇｅｎｅ逡逑Ａ，１／２／３：定點突變各片段，Ｍ：邋Ｄ５０００邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋Ｂ，１：片段邋１／２／３邋重疊延伸產(chǎn)物，Ｍ：邋Ｄ２０００邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ．逡逑Ａ，邋１／２／３：Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ｏｆ邋Ｍｈｐ３７９，邋Ｍ：邋Ｄ５０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｂ，邋１：邋ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋１／２／３，逡逑Ｍ：邋Ｄ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ．逡逑如圖２－４Ａ，邋ＰＣＲ擴(kuò)增了突變Ｍｈｐ５９７基因的各個片段，然后將前三個片段重疊延伸ＰＣＲ連逡逑接成１個（ＩＨ２－４Ｂ），然后再和第四個片段重疊延伸圖２＞４Ｃ）邋？逡逑２６逡逑

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本文編號：2793233