【摘要】：CRISPR系統(tǒng)是來源于細菌的一種適應性免疫防御系統(tǒng),目前,CRISPR已經被雇傭編輯真核生物和原核生物的基因組,并且已發(fā)展成為一種高效準確的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)由CRISPR蛋白和gRNA兩部分組成,CRISPR蛋白負責靶向切割目標基因,gRNA通過堿基互補配對特異指導CRISPR蛋白到目標基因。雖然該系統(tǒng)已經在超過16種的細菌中成功編輯了目標基因,但布魯氏菌等胞內寄生菌仍沒有文獻報道。由于布魯氏菌感染引起的布魯氏菌病在我國,特別是北方地區(qū)流行十分嚴重,目前尚未有良好的防治措施,其感染機制也尚未清晰。如果能成功將CRISPR基因編輯系統(tǒng)引入到布魯氏菌,將會給布魯氏菌疫苗開發(fā)及相關感染機制研究提供強大的工具。因此,本課題將嘗試CRISPR系統(tǒng)編輯布魯氏菌基因的工作。我們取得了如下相關結果。1、以布魯氏菌表達載體pBBR2為骨架,成功構建布魯氏菌磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的pBBR2-cas9-gRNA1/2/3剪切系統(tǒng)(A)。同時,為克服布魯氏菌缺乏非同源末端修復機制的缺點,將PGK基因左右各1000bp的同源臂克隆到pBBR2-cas9-gRNA1/2/3,構建了另一種PGK的pBBR2-cas9-gRNA1/2/3-H編輯系統(tǒng)(B)。將這兩種系統(tǒng)電轉入布魯氏菌S19疫苗株,轉化含有A的布魯氏菌在平板上都不能生長;轉化含有B的布魯氏菌在平板上盡管有少量菌落,但測序檢測皆為陰性。而所有對照組(pBBR2-cas9)的轉化,布魯氏菌的生長正常。該實驗表明組成型CRISPR/cas9系統(tǒng)能剪切布魯氏菌基因組,但是不能修復剪切后的缺口。2、由于pBBR2-cas9-gRNA1/2/系統(tǒng)不能編輯布魯氏菌基因組,我們推測一個可能的原因是細菌來源的cas9脫靶效應,為排除這種可能性。我們利用高忠誠度的組成型CRISPR/Fncpf1和CRISPR/Lbcpf1蛋白,成功構建了pBBR2-Fn/LbCpf1-crRNA剪切系統(tǒng)(C,D),同時,將PGK基因左右各1000bp的同源臂克隆到pBBR2-Fn/Lb Cpf1-crRNA,構建了Fn/Lbcpf1-crRNA1/2/-H(E,F)。將C,D,E,F系統(tǒng)分別電轉入布魯氏菌S19疫苗株,所有轉化的布魯氏菌在平板上都不能生長,但是,對照組(pBBR2-Fn/LbCpf1)的轉化,布魯氏菌的生長正常。該實驗表明脫靶效應應該不是CRISPR不能編輯布魯氏菌基因組的原因。3、由于組成型CRISPR/cas9、CRISPR/FnCpf1和CRISPR/LbCpf1都不能編輯布魯氏菌基因組,我們推測另一個可能的原因來源于CRISPR的cas9或Fn/LbCpf1表達過于持續(xù),同源重組時間不充分。為此,我們成功構建了布魯氏菌IPTG誘導型CRISPR/cas9(pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3(G)及含有PGK同源臂的pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3-H(H))和溫度誘導型CRISPR/cas9系統(tǒng)(pBBR2-cits-cas9-gRNA2(J),及含有PGK同源臂的pBBR2-cits-cas9-gRNA2-H(K))。將G,H,J,K系統(tǒng)分別電轉入布魯氏菌S19疫苗株,然后進行相關的誘導,所有轉化的布魯氏菌在平板上都不能生長,但是,相應的未誘導的對照組的轉化,依然沒有布魯氏菌生長。該實驗表明IPTG誘導系統(tǒng),以及溫敏誘導系統(tǒng)在布魯氏菌中存在泄漏,不能延遲cas9、Lcpf1和Fncpf1剪切的時間,為同源修復提供更長的時間,從另一個角度說明在含有gRNA的CRISPR系統(tǒng)中cas9或其相關蛋白的表達即使微量對布魯氏菌也存在毒性,不能用于編輯布魯氏菌基因組。綜上所述,為了探究CRISPR系統(tǒng)能否成為高效的布魯氏菌基因編輯工具,進行了以上探索研究,成功的構建了5種能切割布魯氏菌基因組的CRISPR系統(tǒng),研究表明傳統(tǒng)的all-in-one CRISPR還不能成功編輯布魯氏菌基因,如何在布魯氏菌中發(fā)揮CRISPR的基因編輯功能,具體的機理機制還有待進一步的研究。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61
【圖文】：

育二抗：用 1×TBST 配制的 5%脫脂奶粉的稀釋辣根過氧膜放入含相應的二抗稀釋液的封口袋中，避免氣泡，平放洗滌同上CL 化學發(fā)光顯色：加入適量 DAB 染色工作液，曝光拍照型 cas9 表達載體 pBBR2-cas9-gRNA-H 的構建閱大量的文獻，本課題組找到來源于 pBBRMCS 廣宿主質動子，可以在布魯氏菌中發(fā)揮作用。同時，又找到 trc 啟以起始 mRNA 的轉錄。因此我們以 pBBRMCS-2 為載體的方法把 trc 啟動子，fd 終止子，gRNA 骨架，T7 終-2 構建 pBBR2-cas9-gRNA-H 載體（圖 1.1）。

Marker；1：pBBR2-cas9BR2-cas9-gRNA 質粒ntification of pBBR2-c1/2/3 載體的構建性帶來的影響，我們選0bp 的核心序列插入到A1/2/3。連接、轉化的構建（圖 1.3），與目

DNA Marker；1：pBBR2-cas9-gRNA2 pBBR2-cas9-gRNA 質粒的 PCR identification of pBBR2-cas9-gRRNA1/2/3 載體的構建隨機性帶來的影響，我們選擇了，把 20bp 的核心序列插入到測序正-gRNA1/2/3。連接、轉化和提 載體的構建（圖 1.3），與目的大

【參考文獻】

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本文編號：2793130