【摘要】：CRISPR系統(tǒng)是來源于細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng),目前,CRISPR已經(jīng)被雇傭編輯真核生物和原核生物的基因組,并且已發(fā)展成為一種高效準(zhǔn)確的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)由CRISPR蛋白和gRNA兩部分組成,CRISPR蛋白負(fù)責(zé)靶向切割目標(biāo)基因,gRNA通過堿基互補(bǔ)配對特異指導(dǎo)CRISPR蛋白到目標(biāo)基因。雖然該系統(tǒng)已經(jīng)在超過16種的細(xì)菌中成功編輯了目標(biāo)基因,但布魯氏菌等胞內(nèi)寄生菌仍沒有文獻(xiàn)報(bào)道。由于布魯氏菌感染引起的布魯氏菌病在我國,特別是北方地區(qū)流行十分嚴(yán)重,目前尚未有良好的防治措施,其感染機(jī)制也尚未清晰。如果能成功將CRISPR基因編輯系統(tǒng)引入到布魯氏菌,將會給布魯氏菌疫苗開發(fā)及相關(guān)感染機(jī)制研究提供強(qiáng)大的工具。因此,本課題將嘗試CRISPR系統(tǒng)編輯布魯氏菌基因的工作。我們?nèi)〉昧巳缦孪嚓P(guān)結(jié)果。1、以布魯氏菌表達(dá)載體pBBR2為骨架,成功構(gòu)建布魯氏菌磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的pBBR2-cas9-gRNA1/2/3剪切系統(tǒng)(A)。同時(shí),為克服布魯氏菌缺乏非同源末端修復(fù)機(jī)制的缺點(diǎn),將PGK基因左右各1000bp的同源臂克隆到pBBR2-cas9-gRNA1/2/3,構(gòu)建了另一種PGK的pBBR2-cas9-gRNA1/2/3-H編輯系統(tǒng)(B)。將這兩種系統(tǒng)電轉(zhuǎn)入布魯氏菌S19疫苗株,轉(zhuǎn)化含有A的布魯氏菌在平板上都不能生長;轉(zhuǎn)化含有B的布魯氏菌在平板上盡管有少量菌落,但測序檢測皆為陰性。而所有對照組(pBBR2-cas9)的轉(zhuǎn)化,布魯氏菌的生長正常。該實(shí)驗(yàn)表明組成型CRISPR/cas9系統(tǒng)能剪切布魯氏菌基因組,但是不能修復(fù)剪切后的缺口。2、由于pBBR2-cas9-gRNA1/2/系統(tǒng)不能編輯布魯氏菌基因組,我們推測一個可能的原因是細(xì)菌來源的cas9脫靶效應(yīng),為排除這種可能性。我們利用高忠誠度的組成型CRISPR/Fncpf1和CRISPR/Lbcpf1蛋白,成功構(gòu)建了pBBR2-Fn/LbCpf1-crRNA剪切系統(tǒng)(C,D),同時(shí),將PGK基因左右各1000bp的同源臂克隆到pBBR2-Fn/Lb Cpf1-crRNA,構(gòu)建了Fn/Lbcpf1-crRNA1/2/-H(E,F)。將C,D,E,F系統(tǒng)分別電轉(zhuǎn)入布魯氏菌S19疫苗株,所有轉(zhuǎn)化的布魯氏菌在平板上都不能生長,但是,對照組(pBBR2-Fn/LbCpf1)的轉(zhuǎn)化,布魯氏菌的生長正常。該實(shí)驗(yàn)表明脫靶效應(yīng)應(yīng)該不是CRISPR不能編輯布魯氏菌基因組的原因。3、由于組成型CRISPR/cas9、CRISPR/FnCpf1和CRISPR/LbCpf1都不能編輯布魯氏菌基因組,我們推測另一個可能的原因來源于CRISPR的cas9或Fn/LbCpf1表達(dá)過于持續(xù),同源重組時(shí)間不充分。為此,我們成功構(gòu)建了布魯氏菌IPTG誘導(dǎo)型CRISPR/cas9(pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3(G)及含有PGK同源臂的pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3-H(H))和溫度誘導(dǎo)型CRISPR/cas9系統(tǒng)(pBBR2-cits-cas9-gRNA2(J),及含有PGK同源臂的pBBR2-cits-cas9-gRNA2-H(K))。將G,H,J,K系統(tǒng)分別電轉(zhuǎn)入布魯氏菌S19疫苗株,然后進(jìn)行相關(guān)的誘導(dǎo),所有轉(zhuǎn)化的布魯氏菌在平板上都不能生長,但是,相應(yīng)的未誘導(dǎo)的對照組的轉(zhuǎn)化,依然沒有布魯氏菌生長。該實(shí)驗(yàn)表明IPTG誘導(dǎo)系統(tǒng),以及溫敏誘導(dǎo)系統(tǒng)在布魯氏菌中存在泄漏,不能延遲cas9、Lcpf1和Fncpf1剪切的時(shí)間,為同源修復(fù)提供更長的時(shí)間,從另一個角度說明在含有g(shù)RNA的CRISPR系統(tǒng)中cas9或其相關(guān)蛋白的表達(dá)即使微量對布魯氏菌也存在毒性,不能用于編輯布魯氏菌基因組。綜上所述,為了探究CRISPR系統(tǒng)能否成為高效的布魯氏菌基因編輯工具,進(jìn)行了以上探索研究,成功的構(gòu)建了5種能切割布魯氏菌基因組的CRISPR系統(tǒng),研究表明傳統(tǒng)的all-in-one CRISPR還不能成功編輯布魯氏菌基因,如何在布魯氏菌中發(fā)揮CRISPR的基因編輯功能,具體的機(jī)理機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61
【圖文】：

育二抗：用 1×TBST 配制的 5%脫脂奶粉的稀釋辣根過氧膜放入含相應(yīng)的二抗稀釋液的封口袋中，避免氣泡，平放洗滌同上CL 化學(xué)發(fā)光顯色：加入適量 DAB 染色工作液，曝光拍照型 cas9 表達(dá)載體 pBBR2-cas9-gRNA-H 的構(gòu)建閱大量的文獻(xiàn)，本課題組找到來源于 pBBRMCS 廣宿主質(zhì)動子，可以在布魯氏菌中發(fā)揮作用。同時(shí)，又找到 trc 啟以起始 mRNA 的轉(zhuǎn)錄。因此我們以 pBBRMCS-2 為載體的方法把 trc 啟動子，fd 終止子，gRNA 骨架，T7 終-2 構(gòu)建 pBBR2-cas9-gRNA-H 載體（圖 1.1）。

Marker；1：pBBR2-cas9BR2-cas9-gRNA 質(zhì)粒ntification of pBBR2-c1/2/3 載體的構(gòu)建性帶來的影響，我們選0bp 的核心序列插入到A1/2/3。連接、轉(zhuǎn)化的構(gòu)建（圖 1.3），與目

DNA Marker；1：pBBR2-cas9-gRNA2 pBBR2-cas9-gRNA 質(zhì)粒的 PCR identification of pBBR2-cas9-gRRNA1/2/3 載體的構(gòu)建隨機(jī)性帶來的影響，我們選擇了，把 20bp 的核心序列插入到測序正-gRNA1/2/3。連接、轉(zhuǎn)化和提 載體的構(gòu)建（圖 1.3），與目的大

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2793130