【摘要】：腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是在腸道中定植,而在腸道外引起疾病的一類大腸桿菌,因其特有的毒力因子可引起人和動物不同類型的疾病。動物源性ExPEC造成養(yǎng)殖業(yè)嚴重的經濟損失,也有公共衛(wèi)生意義。本研究通過對疑似ExPEC感染的禽、豬和水貂進行病原分離鑒定,以明確我國某地區(qū)動物源性ExPEC流行菌株的生物學特性。在此基礎上選擇代表性菌株通過比較基因組學分析,預測可能的毒力基因和特有基因,為ExPEC的分子致病機制的研究奠定基礎,也為ExPEC感染的防控提供理論依據。本研究首先從132份禽、豬和水貂腸道外組織中分離鑒定大腸桿菌,其中53個分離菌株至少攜帶特異性毒力基因pap、sfa/foc、afa/dra、iutA和kpsMT II中的兩種基因,并攜帶fimH、ibeA、hlyA、malX、iss和iroN等其它相關毒力基因,表明為ExPEC;分離菌株對氯霉素、卡那霉素和多粘菌素B等15種抗生素呈現不同程度的多重耐藥性;O抗原主要分布于O1、O2、O8、O11、O38、O78和O120血清型;系統(tǒng)進化分析表明53株ExPEC分離菌株主要屬于A群和B1群,其中28株屬于A群,19株屬于B1群。選取代表性ExPEC分離菌株20株,以不同感染劑量腹腔注射小鼠進行致病性分析,結果表明其中ExPEC分離菌株11株在劑量3×10~7 CFU/只可致所有感染小鼠死亡,對ExPEC53、ExPEC52、ExPEC42和ExPEC6分離菌株進行了毒力測定,結果表明對小鼠的LD_(50)分別為2.38×10~7 CFU/mL,9.48×10~6 CFU/mL,9.49×10~5 CFU/mL和3.49×10~6 CFU/mL。采用Illumina HiSeq技術對ExPEC53和ExPEC52水貂源分離菌株及ExPEC5豬源分離菌株進行了全基因組測序,ExPEC53和ExPEC52全基因組中分別包含1個長度98,080 bp和207,975 bp的質粒,均攜帶四環(huán)素抗性基因,而ExPEC5全基因組不包含質粒。ExPEC53、ExPEC52和ExPEC5分離菌株預測分別包含747、667和703個毒力基因并主要參與細菌的侵襲黏附、分泌系統(tǒng)和鐵離子攝取系統(tǒng);未知功能蛋白數量分別為232、242和232。與參考菌株PCN033(CP006632)基因組相比,ExPEC53、ExPEC52和ExPEC5分離菌株特異基因數量分別為718、393和239個,基因組分別存在365、367和339個插入缺失片段(長度≤50 bp),編碼區(qū)分別存在6,541、6,498和6,493單核苷酸多態(tài)性非同義突變。聚類分析并構建進化樹,結果顯示ExPEC52和ExPEC5分離菌株與菌株PCN033進化位置較近,ExPEC53分離菌株次之。綜上所述,本研究分離鑒定到ExPEC分離菌株53株,明確了其多重耐藥性、O抗原、系統(tǒng)進化特性及對小鼠的致病性;選取ExPEC水貂源分離菌株和豬源分離菌株且血清型為O11的3個分離菌株進行了全基因組重測序及比較基因組學分析,對其基因組結構、特有基因和毒力基因特征等進行了預測和分析,為ExPEC的分子致病機制的研究奠定基礎,也為ExPEC感染的防控提供了理論依據。
【學位授予單位】：黑龍江八一農墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.612
【圖文】：

株的 O 抗原血清檢測菌株按照大腸桿菌 O 抗原血清檢測說明書，分O38、O78、O81、O101、O120、O138、O16：上生長的單個菌落于 2 mL 的 LB 液體培養(yǎng)基內各取 10 μL 新鮮菌液，分兩次滴加到載玻片桿菌 O 抗原血清滴加至載玻片菌液充分混合均位置做空白對照�；旌陷d玻片上的兩種混合液，大約 1 min。圖 2-1 大腸桿菌群系鑒定標準ichotomous decision tree to determine phylogenetic grou

腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定及比較基因組學分析的鑒定分離 E. coli 菌株的基因組為 PCR 模板，通過設計 16S rRNA 引物對菌株進所得 PCR 產物經 0.8-1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示目的條帶大小約預期試驗結果相符（圖 2-3 為 ExPEC6、ExPEC42-45 和 ExPEC51-53 分離菌測序后與 NCBI 中已報道 E. coli MG1655 標準菌株的 16S rRNA 序列進行比 99%以上，表明分離株均為 E. coli。M 1 2 3 456789

有效 reads 數、總分之一錯誤堿基率，Q30%表2 3 個分離菌株原始測序數據過濾nd statisticd sequencing data of orig基數（bp） 有效 Reads 數 有效2951300 10598708 9873600 9107362 0258700 8871718 3-1 3 個分離菌株 PCR 鑒定結株；2：ExPEC52 株；ExPEC5 株；-1 PCR identification results of 3 in; 2: ExPEC52 strain; 3: ExPEC5 st

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