【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一種危害極大的禽類傳染病,該病的流行給全世界的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失,19世紀(jì)曾發(fā)生過雞群的大量死亡,后來科學(xué)家將這種疾病稱為禽流感。隨著禽流感的流行,現(xiàn)在禽流感病毒(AIV)已經(jīng)出現(xiàn)了很多種亞型,其中H9N2亞型是其中的一種低致病性的亞型病毒,在漫長的時(shí)間里,H9N2已經(jīng)是較流行的禽流感病毒的亞型之一,所以如何預(yù)防禽流感一直是研究熱點(diǎn)。血凝素(Hemagglutinin,HA)是AIV上的重要蛋白,AIV侵襲細(xì)胞的關(guān)鍵。研究表明,HA在機(jī)體內(nèi)分解出HA2,HA2是重要的保守性抗原,一直是研究通用型疫苗的研究熱點(diǎn)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)在抗原呈遞過程中發(fā)揮重要的作用,CD205/DEC-205是DCs表面上的C型凝集素跨膜蛋白,DEC-205充當(dāng)內(nèi)吞受體時(shí),它加強(qiáng)DC的抗原攝取以及抗原遞呈作用,目前已有很多文獻(xiàn)證明了DEC205在抗原靶向DC過程中起到了這一作用。目前市場(chǎng)上流行的大多是全病毒滅活疫苗,且疫苗主要是通過雞胚培養(yǎng)或者是細(xì)胞培養(yǎng)的方式得到。但雞胚培養(yǎng)方式工藝復(fù)雜且一定程度上易殘留卵清蛋白,對(duì)雞蛋過敏的是不能通過這種方式獲得免疫的,細(xì)胞培養(yǎng)的方式容易污染且成本較高。所以研究出既安全又簡(jiǎn)便的禽流感疫苗是一個(gè)重要的問題。本實(shí)驗(yàn)研究的是通過減毒延遲裂解型沙門菌遞送禽流感HA2抗原預(yù)防H9N2型禽流感的DNA疫苗。本實(shí)驗(yàn)具體研究?jī)?nèi)容如下及結(jié)果如下:(一)靶向DCs的H9N2亞型禽流感病毒HA2抗原的裂解型沙門菌構(gòu)建及反應(yīng)原性研究。以合成的質(zhì)粒αDEC205-HA為模板,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到目的片段scFvDEC205-HA2和scFvDEC205-HA2-dimer,其中dimer是一種二聚體,可以結(jié)合雙倍的scFvDEC205和HA2,把這兩個(gè)目的片段與pYA4545載體連接構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pYA4545-HA2-scFvDEC205和pYA4545-HA2-scFvDEC205-dimer,分別命名為HA2-scFv DEC205和HA2-scFvDEC205-dimer,中提質(zhì)粒以脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的HEK-293T細(xì)胞中,培養(yǎng)48h后提取總蛋白,Western-blot和間接免疫熒光驗(yàn)證目的蛋白成功表達(dá)后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入沙門菌χ11218,分別命名為pYL9,pYL11。(二)沙門菌pYL9和pYL11的免疫效果研究。將60只小鼠隨機(jī)分成6組,每組10只小鼠,分為已構(gòu)建好的pYL9和pYL11和實(shí)驗(yàn)室已有的χ11218(pYA4545)組(Empty vector組)、χ11218(pYA4545-HA2)組(HA2組),同時(shí)設(shè)立生理鹽水組(Saline組)和滅活疫苗組(Vaccine組),除了Vaccine組外,其余各組在第一次免疫后在每隔14天加強(qiáng)免疫一次,一共口服免疫4次,劑量為1×10~9CFU/只。其中Vaccine組的小鼠在第一次免疫時(shí)采用頸部皮下注射的方式進(jìn)行免疫且只免疫一次。在第四次免疫后取小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和PP結(jié),通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析各組小鼠的DCs成熟分化情況以及T細(xì)胞分化情況,在免疫的第21和35天分別取小鼠血清,利用ELISA檢測(cè)小鼠血清中抗體滴度以及細(xì)胞因子的水平,四次免疫的一周后每組隨機(jī)挑選出7只小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn),攻毒劑量10~5EID_(50)即50μL/只,攻毒后14天內(nèi)記錄小鼠的體重變化以及死亡率,攻毒的14天后取小鼠肺部制作肺部的病理切片,觀察各組小鼠肺部的病理損傷情況。結(jié)果顯示:本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)沙門菌pYL9和pYL11免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)與Saline組和Empty vector組相比小鼠脾臟中CD3~+CD4~+T細(xì)胞比例顯著上升5.1%,5.4%(P0.01),且與Empty vector組和HA2組相比pYL11組的CD3~+CD4~+T細(xì)胞中IL-4~+細(xì)胞占比顯著上升了1.49%,1.63%(P0.05),與Empty vector組相比pYL11組CD3~+CD4~+T細(xì)胞中IFN-γ~+細(xì)胞含量顯著升高了1.25%(P0.01),與HA2組相比pYL11組IFN-γ~+細(xì)胞含量顯著升高了1.61%(P0.001);與Saline組相比pYL11組脾臟中CD3~+CD8~+T比例也顯著上升了2.56%(P0.01)且與Empty vector組相比pYL11組的IFN-γ~+T細(xì)胞含量顯著升高了0.49%(P0.05)。脾臟中與Empty vector組相比pYL11組的DCs的CD83表達(dá)顯著增多了0.41%(P0.05),CD86表達(dá)顯著增多了34.8%(P0.001),腸系膜淋巴結(jié)中與Empty vector組相比pYL11組的DCs的CD80表達(dá)顯著增多了1.67%(P0.05),PP結(jié)中與Empty vector組相比pYL11組的DCs的CD80表達(dá)顯著增多了0.42%(P0.05)。ELISA分析血清中抗體滴度和細(xì)胞因子水平結(jié)果表明:在免疫的第21和35天時(shí),與Empty vector組相比pYL11組的抗體滴度顯著升高了0.6%,0.28%(P0.05),與HA2組相比pYL11組血清中IFN-γ含量顯著升高了(P0.01)。攻毒后各組小鼠體重均開始下降,第七天時(shí)體重降到最低,pYL11組體重下降幅度較輕,生存曲線結(jié)果表明,pYL11組存活率為85.7%,Vaccine組的存活率也為85.7%,Empty vector和Saline組分別為57.1%和28.5%。各組小鼠肺部病理切片的HE染色結(jié)果說明,pYL11組和pYL9組還有Vaccine組的病理變化較輕,Saline組和Empty vector組的小鼠肺部均有嚴(yán)重的肺部間質(zhì)增厚,炎性細(xì)胞浸潤增多的現(xiàn)象。綜上所述,免疫小鼠后減毒沙門菌pYL9和pYL11組小鼠的CD3~+CD4~+T細(xì)胞和CD3~+CD8~+T細(xì)胞占比顯著上升,且IL4~+T細(xì)胞和IFN-γ~+T細(xì)胞含量都顯著上升,DCs表達(dá)的CD80、CD83、CD86顯著上升,血清中抗體水平上升,攻毒后小鼠沙門菌組小鼠的肺部病變程度要輕于對(duì)照組,說明沙門菌pYL9和pYL11對(duì)小鼠抵抗H9N2感染具有一定的保護(hù)效果,其中pYL11組效果更佳。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

圖 2：HA2-scFvDEC205 基因片段的擴(kuò)增子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：HA2-scFvDEC205 基因片段的ig.2Amplification of HA2-scFvDEC205 geneAMarker；1：Product for HA2-scFvDEC205 gedimer 基因的 PCR 擴(kuò)增 的基因片段，其大小與設(shè)想的一致（見圖2010bpM 15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp

HA2-scFvDEC205 基因片量標(biāo)準(zhǔn)；1：HA2-scFvDEmplification of HA2-scFvDrker；1：Product for HA2 基因的 PCR 擴(kuò)增因片段，其大小與設(shè)想M 1

pYA4545-HA2-scFvDEC205 菌落 PCR 鑒定準(zhǔn)；1：HA2-scFvDEC205 基因片段；2：陰性；3：陽性545-HA2-scFvDEC205 colony PCR identificationker; 1: HA2-scFvDEC205 gene fragment; 2 : negative contro3:positive controlM 1 2 32010bp

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 華宇;;如何面對(duì)禽流感?[J];紫光閣;2004年03期

2 何浙生;;禽流感病毒的生物學(xué)特性與檢測(cè)方法[J];浙江檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2004年01期

3 魏傳芳;李詠梅;;禽流感病毒與人類流感病毒的關(guān)系[J];萊鋼科技;2006年02期

4 王瀟;曹琛福;黃超華;林彥星;花群義;賈偉新;;禽流感病毒H5亞型RT-exoRPA檢測(cè)方法的建立[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2018年12期

5 楊紅杰;;禽流感疾病的預(yù)防控制思路探討[J];農(nóng)村實(shí)用技術(shù);2019年05期

6 曹藍(lán);馬鈺;陳藝韻;魯恩潔;李魁彪;狄飚;;2016年廣州市禽類交易市場(chǎng)禽流感病毒監(jiān)測(cè)與分析[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2018年05期

7 李偉;王松;李寧;;我國禽流感的研究進(jìn)展及成就[J];當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè);2018年06期

8 劉秀梵;;加強(qiáng)監(jiān)測(cè),從源頭控制和根除家禽流感病毒[J];北方牧業(yè);2018年15期

9 孫燕;李治;;禽流感病毒 跨越物種傳播的研究[J];中學(xué)生物教學(xué);2005年12期

10 王路;惠永華;趙建東;衛(wèi)陸梅;王偉杰;燕素萍;;不同禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的比較[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2016年24期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳化蘭;;禽流感病毒與公共衛(wèi)生[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2014年

2 春陽;李東;;再論“以科學(xué)發(fā)展觀應(yīng)對(duì)禽流感事件”——評(píng)禽流感病毒變種兩次恐慌論[A];首屆中國黃羽肉雞行業(yè)發(fā)展大會(huì)會(huì)刊[C];2008年

3 鄧潔麗;段明星;俞初一;江龍;;聚聯(lián)乙炔有序組裝體在識(shí)別禽流感病毒方面的應(yīng)用研究[A];中國化學(xué)會(huì)第十二屆膠體與界面化學(xué)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

4 李嬌;王金良;管宇;沈志強(qiáng);;禽流感病毒診斷方法的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2009年

5 孫恩澤;謝敏;趙海粟;黃碧海;劉書琳;張萬坡;張志凌;王漢中;龐代文;;量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感病毒[A];第六屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 劉桂林;王志宇;張珊珊;;RNAi技術(shù)及其在抗禽流感病毒感染中的應(yīng)用[A];全國動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

7 王志宇;張議文;劉桂林;;禽流感病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];全國動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

8 王志宇;劉桂林;張議文;梁仲;張珊珊;衛(wèi)吉蕓;;禽流感病毒的分子診斷技術(shù)[A];全國動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

9 劉麗玲;王秀榮;陳化蘭;;real-time RT-PCR檢測(cè)禽流感病毒的初步探討[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

10 李艷華;佟恒敏;于康震;;抗禽流感病毒中草藥的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2003年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 王靜;禽流感傳播罪魁：家禽還是候鳥[N];中國科學(xué)報(bào);2012年

2 趙熙熙;美重啟爭(zhēng)議性禽流感病毒實(shí)驗(yàn)[N];中國科學(xué)報(bào);2019年

3 王方 編譯;亞洲馬為何不怕禽流感[N];中國科學(xué)報(bào);2019年

4 本報(bào)記者 周映夏 通訊員 黃海航;注意防控禽流感和流感[N];中山日?qǐng)?bào);2019年

5 刁有祥;規(guī)�；唸�(chǎng)禽流感的防控措施[N];河北科技報(bào);2017年

6 本報(bào)記者 董碧水;杭州全面防控禽流感 禽蛋業(yè)遭受打擊[N];中國青年報(bào);2013年

7 記者 王夢(mèng)婕 實(shí)習(xí)生 謝宛霏;北京進(jìn)入防控禽流感應(yīng)急狀態(tài)[N];中國青年報(bào);2013年

8 本報(bào)記者 劉坤U

本文編號(hào)：2791012