發(fā)布時間：2020-08-12 18:46

【摘要】：PTEN(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten)基因是人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因,屬于蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTP)基因家族。PTEN基因最初被認為是抑癌基因,但是PTEN基因也在哺乳動物細胞的生長、器官的發(fā)育以及糖代謝、胰島素抵抗等方面發(fā)揮作用。因此,探究PTEN基因在山羊上的表達特征和作用機制具有重要意義。本研究通過克隆山羊PTEN基因編碼區(qū)全序列以及3'UTR區(qū)域變異位點的檢測,探究PTEN基因的分子特征。RT-qPCR的方法檢測了其在胚胎期90天(E90)、胚胎期135天(E135)和出生后90天(P90)的山羊心、肝、脾、肺、腎、腦、腰大肌和背最長肌8個組織中的表達差異以及在山羊前體脂肪細胞分化過程中PTEN基因的表達特征。主要結(jié)果如下:1、簡州大耳羊PTEN基因的編碼區(qū)長度為1212 bp,編碼403個氨基酸。其GenBank登錄號為:MG923848。PTEN蛋白是親水蛋白,含有26個磷酸化位點,1個信號肽。山羊的PTEN基因序列與綿羊,牛PTEN基因親緣關系較近,與馬PTEN基因親緣關系最遠。在PTEN基因的3'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個SNPs和1個indel,分別是g.84 TC(rs648781865),g.996 TC(rs 661678942)和未報道的g.1007 CA,g.1103_104 de lAT。2、RT-qPCR結(jié)果顯示PTEN基因在E90、E135和P90簡州大耳羊的心、肝、脾、肺、腎、腦、腰大肌和背最長肌組織中均有表達。E90的肝組織中檢測到的PTEN基因表達水平相對較高(P0.05);E135的肺組織中檢測到的PTEN基因表達水平相對較高(P0.05),心和腰大肌中表達水平較低(P0.05);P90的脾組織中PTEN表達量較高(P0.05)。蛋白免疫印跡雜交結(jié)果顯示,在E135的8個組織中,PTEN蛋白在心、脾和腦組織中表達量顯著高于其他五個組織(P0.05),而背最長肌中的表達量顯著低于其他7個組織(P0.05)。此外,PTEN蛋白在簡州大耳羊肺組織中的表達量隨日齡呈下降趨勢。3、DAB顯色原位雜交的方法檢測了PTEN基因在P90簡州大耳羊8個組織中的分布規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN基因在肝、脾、肺和腎組織中表達較高,在心、腦和腰大肌和背最長肌中表達較低,與RT-qPCR的結(jié)果一致。4、探究PTEN基因在山羊前體脂肪細胞分化過程中的表達變化,結(jié)果PTEN基因的表達量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,在分化第10天略有升高。而且分化第2天PTEN基因的表達量顯著高于其他4個時間點(P0.05)。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S827
【圖文】：

析測脂糖凝膠電泳檢測從組織中提取的總 RNA，得出 28S 條帶比 18S 條帶亮度更高，表明總 RNA 質(zhì)量現(xiàn)，所提取的組織樣品總 RNA 的 A260/A280 的樣品總 RNA 純度較好，可以用于之后的實驗。

圖 3.1 總 RNA 電泳檢測圖Fig 3.1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA克隆與序列分析克隆結(jié)果取的總 RNA 合成 cDNA 為模版進行 PCR 擴增，之后取 檢測。三個目的片段分別為 485 bp、1180 bp 和 489 bp

2.3 PTEN 基因序列同源性分析及進化樹的構(gòu)建用 DNAman6.0 將簡州大耳羊 PTEN 基因氨基酸序列與其他物種 PTEN 基因氨基序列進行比對。結(jié)果顯示 PTEN 氨基酸序列與綿羊（Ovis aries）、牛（Bos taurus）（Sus scrofa）的相似性分別達到 96.28%、100%和 99.51%。使用 MEGE6.0 軟件構(gòu)建 PTEN 基因氨基酸序列的分子進化樹。結(jié)果顯示山羊EN 基因與野牛，綿羊，牛 PTEN 基因親緣關系較近，與馬 PTEN 基因親緣關系，不同物種 PTEN 基因的氨基酸序列差異如圖。

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本文編號：2790887