發(fā)布時(shí)間：2020-08-12 18:46

【摘要】：PTEN(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten)基因是人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因,屬于蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTP)基因家族。PTEN基因最初被認(rèn)為是抑癌基因,但是PTEN基因也在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、器官的發(fā)育以及糖代謝、胰島素抵抗等方面發(fā)揮作用。因此,探究PTEN基因在山羊上的表達(dá)特征和作用機(jī)制具有重要意義。本研究通過(guò)克隆山羊PTEN基因編碼區(qū)全序列以及3'UTR區(qū)域變異位點(diǎn)的檢測(cè),探究PTEN基因的分子特征。RT-qPCR的方法檢測(cè)了其在胚胎期90天(E90)、胚胎期135天(E135)和出生后90天(P90)的山羊心、肝、脾、肺、腎、腦、腰大肌和背最長(zhǎng)肌8個(gè)組織中的表達(dá)差異以及在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中PTEN基因的表達(dá)特征。主要結(jié)果如下:1、簡(jiǎn)州大耳羊PTEN基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1212 bp,編碼403個(gè)氨基酸。其GenBank登錄號(hào)為:MG923848。PTEN蛋白是親水蛋白,含有26個(gè)磷酸化位點(diǎn),1個(gè)信號(hào)肽。山羊的PTEN基因序列與綿羊,牛PTEN基因親緣關(guān)系較近,與馬PTEN基因親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。在PTEN基因的3'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNPs和1個(gè)indel,分別是g.84 TC(rs648781865),g.996 TC(rs 661678942)和未報(bào)道的g.1007 CA,g.1103_104 de lAT。2、RT-qPCR結(jié)果顯示PTEN基因在E90、E135和P90簡(jiǎn)州大耳羊的心、肝、脾、肺、腎、腦、腰大肌和背最長(zhǎng)肌組織中均有表達(dá)。E90的肝組織中檢測(cè)到的PTEN基因表達(dá)水平相對(duì)較高(P0.05);E135的肺組織中檢測(cè)到的PTEN基因表達(dá)水平相對(duì)較高(P0.05),心和腰大肌中表達(dá)水平較低(P0.05);P90的脾組織中PTEN表達(dá)量較高(P0.05)。蛋白免疫印跡雜交結(jié)果顯示,在E135的8個(gè)組織中,PTEN蛋白在心、脾和腦組織中表達(dá)量顯著高于其他五個(gè)組織(P0.05),而背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著低于其他7個(gè)組織(P0.05)。此外,PTEN蛋白在簡(jiǎn)州大耳羊肺組織中的表達(dá)量隨日齡呈下降趨勢(shì)。3、DAB顯色原位雜交的方法檢測(cè)了PTEN基因在P90簡(jiǎn)州大耳羊8個(gè)組織中的分布規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN基因在肝、脾、肺和腎組織中表達(dá)較高,在心、腦和腰大肌和背最長(zhǎng)肌中表達(dá)較低,與RT-qPCR的結(jié)果一致。4、探究PTEN基因在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化,結(jié)果PTEN基因的表達(dá)量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),在分化第10天略有升高。而且分化第2天PTEN基因的表達(dá)量顯著高于其他4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S827
【圖文】：

析測(cè)脂糖凝膠電泳檢測(cè)從組織中提取的總 RNA，得出 28S 條帶比 18S 條帶亮度更高，表明總 RNA 質(zhì)量現(xiàn)，所提取的組織樣品總 RNA 的 A260/A280 的樣品總 RNA 純度較好，可以用于之后的實(shí)驗(yàn)。

圖 3.1 總 RNA 電泳檢測(cè)圖Fig 3.1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA克隆與序列分析克隆結(jié)果取的總 RNA 合成 cDNA 為模版進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，之后取 檢測(cè)。三個(gè)目的片段分別為 485 bp、1180 bp 和 489 bp

2.3 PTEN 基因序列同源性分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建用 DNAman6.0 將簡(jiǎn)州大耳羊 PTEN 基因氨基酸序列與其他物種 PTEN 基因氨基序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示 PTEN 氨基酸序列與綿羊（Ovis aries）、牛（Bos taurus）（Sus scrofa）的相似性分別達(dá)到 96.28%、100%和 99.51%。使用 MEGE6.0 軟件構(gòu)建 PTEN 基因氨基酸序列的分子進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示山羊EN 基因與野牛，綿羊，牛 PTEN 基因親緣關(guān)系較近，與馬 PTEN 基因親緣關(guān)系，不同物種 PTEN 基因的氨基酸序列差異如圖。

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