發(fā)布時(shí)間：2020-08-12 03:56

【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)是由囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)后獲得的一種高度未分化細(xì)胞,因其具有無限生長(zhǎng)和多向分化潛能,在發(fā)育生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、疾病研究等方面呈現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。目前研究人員已培養(yǎng)獲得小鼠、人、大鼠、猴等哺乳動(dòng)物的ESCs,而家畜ESCs的分離和建系仍有待深入探索。家畜動(dòng)物ESCs的研究有助于闡明胚胎早期發(fā)育機(jī)理和胚胎細(xì)胞多能性的調(diào)節(jié)機(jī)制,同時(shí)在家畜育種方面,尤其是與基因編輯相結(jié)合的遺傳修飾動(dòng)物的生產(chǎn)中具有重要價(jià)值。本研究以mTseR1干細(xì)胞培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,以L Wnt-3A/MEF混合細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,通過添加DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza C、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase3β,GSK3β)抑制劑CHIR99021以及促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase kinase,MEK)抑制劑PD032901等藥物的不同組合,對(duì)經(jīng)免疫外科法分離的牛體外受精囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)進(jìn)行培養(yǎng),探討不同培養(yǎng)體系對(duì)牛類胚胎干細(xì)胞(bovine embryonic stem like cells,bESLCs)生長(zhǎng)和多能性維持的影響。結(jié)果表明:1.與基礎(chǔ)培養(yǎng)液(可傳至第8代)相比,在經(jīng)5AMT(5-Aza C)、2iMT(CHIR99021+PD032901)、3iMT(CHIR99021+PD032901+5-Aza C)組合培養(yǎng)后,bESLCs的傳代次數(shù)均有提高,最高傳代次數(shù)分別達(dá)到第15代、第12代和第17代,其中添加5-Aza C的培養(yǎng)體系(5AMT組和3iMT組)能顯著提高ICM細(xì)胞的貼壁率和原代克隆形成率,5AMT、2iMT、3iMT培養(yǎng)體系中細(xì)胞克隆能夠更長(zhǎng)時(shí)間保持未分化形態(tài)。四種培養(yǎng)體系所獲得的bESLCs克隆均呈扁平形態(tài),細(xì)胞邊緣清晰且具有正常的核型,呈堿性磷酸酶染色陽性。其中,3iMT培養(yǎng)體系中的bESLCs能表達(dá)NANOG、OCT4、SOX2、CDX2、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81等多能性標(biāo)志因子,并能在體外分化培養(yǎng)后形成類胚體,免疫熒光檢測(cè)表明類胚體細(xì)胞表達(dá)三個(gè)胚層的特異蛋白。上述結(jié)果表明我們獲得bESLCs具有ESCs的基本特征。為探討四種培養(yǎng)體系所獲得的bESLCs多能性差異及不同小分子抑制物的作用,本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了四種培養(yǎng)體系中第五代bESLCs的多能性相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果表明添加5-Aza C的培養(yǎng)體系中(5AMT、3iMT)bESLCs的OCT4、NANOG、SOX2、STAT3基因的表達(dá)有顯著提高,2iMT培養(yǎng)體系中SOX2表達(dá)也有上升。隨后用亞硫酸氫鹽PCR方法檢測(cè)了四種培養(yǎng)體系中bESLCs的多能性基因NANOG和SOX2啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,藥物處理組NANOG啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)沒有差異,而SOX2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA發(fā)生明顯去甲基化,且差異顯著。上述結(jié)果表明2i和5-Aza C能夠有效促進(jìn)bESLCs多能性相關(guān)基因表達(dá)。bESLCs在以上體系中培養(yǎng)及傳代過程中形成不同形態(tài)的克隆,本研究比較了不同克隆形態(tài)、傳代方法等對(duì)細(xì)胞多能性的影響。bESLCs克隆的中間區(qū)域(central multilayer,CMt)和邊緣區(qū)域(peripheral monolayer,PMn)細(xì)胞有明顯形態(tài)差異,且CMt區(qū)域細(xì)胞堿性磷酸酶染色著色更深。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CMt中多能性基因OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)水平顯著高于PMn區(qū)域細(xì)胞,而PRDM14、OTX2和滋養(yǎng)層細(xì)胞標(biāo)志基因CDX2的表達(dá)模式正好相反,因此本研究只挑取CMt細(xì)胞進(jìn)行傳代。通過對(duì)比不同代次的bESLCs克隆形態(tài),表明隨著代次提高,細(xì)胞克隆會(huì)變得透明、邊緣不清晰,細(xì)胞中多能性基因NANOG、SOX2、C-MYC表達(dá)有顯著降低,OCT4表達(dá)并無差別,而CDX2、STAT3、EZH2表達(dá)量有顯著提高。此外還對(duì)比了立體形態(tài)和扁平形態(tài)克隆中bESLCs的多能性相關(guān)基因表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明兩種形態(tài)克隆bESLCs之間OCT4、GATA6、C-MYC m RNA表達(dá)量并無差異,立體狀克隆bESLCs中NANOG、SOX2、CDX2、CDH1、FGFR2表達(dá)量的表達(dá)量低于扁平狀克隆bESLCs,而STAT3、CDH2的表達(dá)量高與扁平克隆bESLCs。綜上所述,本研究表明5-AMT、2iMT和3iMT培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的bESLCs具有ESCs基本特征,添加5-Aza C可以提高bESLCs的分離效率,2i抑制劑和5-Aza C能夠有效促進(jìn)bESLCs多能性標(biāo)記表達(dá)并抑制其分化。綜合細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、傳代次數(shù)、多能性基因表達(dá)等,3iMT培養(yǎng)體系更適合bESLCs的體外培養(yǎng)和多能性維持。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823
【圖文】：

圖 2.1 牛類胚胎干細(xì)胞的傳代過程。Figure 2.1 Passage of Bovine Embryonic Stem like Cells.磷酸酶染色長(zhǎng)旺盛的第 5 代 bESLCs，用 PBS 洗三次，加入 4%多聚甲醛室溫固定 10 m胞用 PBS 洗三次，再根據(jù)試劑盒說明書向每 5 mL 堿性磷酸酶緩沖液（100 mM MgCl2，150 mM NaCl）中按順序加入 33 μL NBT 和 16.5 μL BCIP 迅速，避光染色 10-40 min。不斷觀察染色結(jié)果，顯色后上鏡拍照。熒光染色熒光染色的細(xì)胞需要接種在放蓋玻片的四孔板中。操作如下:取傳代第4-5天洗一次，向孔內(nèi)加入 4％多聚甲醛室溫固定 10 min，固定后用 PBS 洗 3 次，每PBS 洗均為 5 min）。通透:加入 0.8％ Triton-X100 室溫通透細(xì)胞 20 min，用閉：加入封閉液（用 DPBS 稀釋的 10%山羊血清或加入 1%BSA 的 PBS）室一抗：用封閉液按比例稀釋一抗，用封口膜包好 4°C 過夜。孵育二抗:用移

內(nèi)蒙古大學(xué) 碩士學(xué)位論文表 2.8 牛囊胚 ICM 來源的細(xì)胞在不同培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)情況Table2.8 The cells from bovine blastocysts ICM in different culture systems培養(yǎng)體系 內(nèi)細(xì)胞團(tuán) 貼壁率（%） 原代克隆形成率（%） 最高代次Culture system ICM Adhesive rate Primary clone-forming rate Highest passagesMT 30 16(53) 11(36) P85AMT 39 31(79) 16(41) P152iMT 40 23(58) 16(40) P123iMT 33 29(88) 16(48) P17四種培養(yǎng)體系中分離獲得 bESLCs 的傳代次數(shù)也具有明顯差異。在傳代過程中有的克隆穩(wěn)定傳代，有的克隆在傳代初期就會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，克隆變得比較透明，最終死亡。在 MT體系中 bESLCs 最高可傳到第 8 代，而在 5AMT、2iMT、3iMT 體系中分別最高可傳到 15、12、17 代，其中 3iMT 培養(yǎng)體系中 bESLCs 平均傳代次數(shù)較高。

圖 2.3 四種培養(yǎng)體系中 bESLCs 的形態(tài)。（圖中標(biāo)尺為 100 μm)Fig 2.3 The morphology of bESLCs in four culture systems.（The scale bar is 100 μm）1.3 牛類胚胎干細(xì)胞增殖檢測(cè)通過 Brdu 熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)我們獲得四種培養(yǎng)體系 bESLCs 克隆的 CMt 區(qū)域和 PMt 區(qū)域均有 Brdu 陽性細(xì)胞的存在，表明 bESLCs 在四種培養(yǎng)體系中都能夠在正常增殖（圖 2.8）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫國(guó)杰,桑潤(rùn)滋,韓建永,金東航,田樹軍,周振明,李俊杰;山羊類胚胎干細(xì)胞的分離、克隆研究[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年03期

本文編號(hào)：2790013