【摘要】：兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起成年兔的一種急性、致死性、接觸性傳染病,以呼吸系統(tǒng)出血和急性肝壞死為特征,是造成養(yǎng)兔業(yè)巨大損失的一種重要傳染病。本病于1984年首先在我國(guó)江蘇省爆發(fā),隨即蔓延到世界各地。目前,免疫接種仍然是防治兔出血癥的主要措施。由于RHDV沒有適合培養(yǎng)的細(xì)胞系,現(xiàn)在商品化疫苗均為組織滅活苗。雖然滅活苗安全有效,但存在著成本昂貴、生物安全和動(dòng)物福利等諸多缺點(diǎn)。因此,探索研制安全、有效、成本低廉的新型兔出血癥疫苗具有現(xiàn)實(shí)意義。VP60蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原,在誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,是RHDV基因工程疫苗的首選蛋白。犬2型腺病毒(Canine adenovirus type 2,CAV2)是一種良好的病毒表達(dá)載體,具有易培養(yǎng)、重組病毒滴度高、外源蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn),對(duì)兔不致病,安全性好,可用于RHDV疫苗研發(fā)。本研究旨在構(gòu)建表達(dá)RHDV vp60基因的E3區(qū)缺失的重組犬2型腺病毒r CAV2-VP60,并對(duì)其生長(zhǎng)能力和遺傳穩(wěn)定性等生物學(xué)特性以及在兔體內(nèi)的免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià),為研制RHDV新型病毒活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。本研究首先利用細(xì)菌內(nèi)同源重組技術(shù)將CAV2 HLJ-10株的全基因組克隆到p Shuttle-CMV載體上,構(gòu)建了含有CAV2全基因組的骨架載體p CAV2。其次,采用融合PCR方法將E3區(qū)側(cè)翼序列(23903-24933bp和26412-28055bp)和pc DNA3.1(+)的CMV表達(dá)盒序列(232-1252bp)融合在一起,并將其克隆到p UC18載體上,構(gòu)建了E3區(qū)缺失的穿梭載體p UC-ΔE3-CMV。在此基礎(chǔ)上,將egfp基因定向克隆到穿梭載體p UC-ΔE3-CMV上,再利用穿梭載體和骨架載體共有的酶切位點(diǎn)Nru I和Sal I將含有egfp基因的表達(dá)盒克隆到骨架載體p CAV2上得到了重組病毒質(zhì)粒p CAV2-EGFP,用特異性的內(nèi)切酶Asc I酶切釋放出重組基因組,轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后獲得了重組病毒r CAV2-EGFP。經(jīng)鑒定該重組病毒能在MDCK細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)EGFP,一步生長(zhǎng)曲線與親本毒CAV2相似。這表明本研究利用p CAV2和p UC-ΔE3-CMV通過體外連接的方法構(gòu)建重組犬2型腺病毒的策略是可行的,為下一步構(gòu)建表達(dá)RHDV vp60基因的重組病毒r CAV2-VP60提供了技術(shù)平臺(tái)。本研究利用PCR方法從質(zhì)粒pc DNA-VP60中擴(kuò)增出RHDV vp60基因,將其定向克隆到p UC-ΔE3-CMV中,再通過Nru I和Sal I特異性酶切位點(diǎn)將含有vp60基因的表達(dá)盒克隆到p CAV2中,獲得了重組質(zhì)粒p CAV2-VP60,用Asc I酶切釋放出重組基因組后轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞成功拯救出重組病毒r CAV2-VP60。PCR鑒定顯示vp60基因成功插入到r CAV2-VP60基因組中,將該重組病毒連續(xù)傳代20次,PCR鑒定顯示其具有良好的遺傳穩(wěn)定性;Western blot和IFA鑒定表明該重組病毒能在MDCK細(xì)胞中表達(dá)VP60蛋白,表達(dá)的VP60蛋白具有良好的抗原性;一步生長(zhǎng)曲線表明其生長(zhǎng)特性與親本毒CAV2相似,病毒滴度最高可達(dá)107.5 TCID50/0.1m L。將此重組病毒r CAV2-VP60以107 TCID50/1m L接種RHDV非免疫兔,兩周后加強(qiáng)免疫一次,同時(shí)與RHDV滅活苗和親本毒CAV2進(jìn)行免疫效果比較,結(jié)果表明r CAV2-VP60組和RHDV滅活苗組在加強(qiáng)免疫后1周均檢測(cè)到RHDV特異性抗體,并于加強(qiáng)免疫后3周達(dá)到高峰,之后開始下降,攻毒后抗體又迅速升高。r CAV2-VP60組免疫兔的T淋巴細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4含量均高于親本毒CAV2組。用致死劑量的RHDV HYD株滴鼻攻擊后,r CAV2-VP60組和RHDV滅活苗組所有家兔均未死亡,沒有出現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化,而親本毒CAV2組所有家兔在攻毒后2天內(nèi)全部死亡,臨床癥狀及病理變化都很明顯。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了含有CAV2全基因組的骨架載體p CAV2和E3區(qū)缺失的穿梭載體p UC-ΔE3-CMV,利用此系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)RHDV vp60基因的重組病毒r CAV2-VP60,該重組病毒能在MDCK細(xì)胞中表達(dá)VP60蛋白,并具有良好的遺傳穩(wěn)定性,與親本毒CAV2的生長(zhǎng)特性相似。家兔試驗(yàn)表明,該重組病毒r CAV2-VP60能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),免疫兔能夠完全抵抗RHDV強(qiáng)毒的攻擊。本研究為研制RHDV新一代病毒載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.291

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本文編號(hào)：2789990