【摘要】：隨著生活水平的提高,肉類(lèi)食品在食物構(gòu)成中所占的比例不斷增加,人們對(duì)肉類(lèi)食品品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。目前,國(guó)內(nèi)肉用牛養(yǎng)殖中品種繁多,牛肉產(chǎn)量偏低、品質(zhì)也參差不齊,牛肉的產(chǎn)量和質(zhì)量已不能滿(mǎn)足人們的需求。通過(guò)遺傳育種的方式獲得高品質(zhì)的肉牛品種是目前解決這一問(wèn)題最快速有效的方法。另外,在骨骼肌受到損傷時(shí),潛伏的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以通過(guò)增殖和分化完成肌纖維的再生,修復(fù)損傷的肌肉組織。因此,研究肌肉分化的機(jī)理不僅具有巨大的商業(yè)價(jià)值,也能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)相關(guān)疾病的治療提供新思路。Ran(Ras-related nuclear protein,Ran)作為真核生物細(xì)胞中含量最為豐富的小G蛋白,參與細(xì)胞分裂間期的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄;在細(xì)胞分裂期參與核膜破裂、紡錘體組裝、染色體分配、核膜裝配和細(xì)胞分裂等細(xì)胞過(guò)程。肌肉分化是肌源性細(xì)胞通過(guò)增殖、分化和彼此間相互融合成多核肌管,并最終形成具有收縮功能的肌纖維的過(guò)程。本研究以小鼠C2C12成肌細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)Ran的過(guò)表達(dá)和siRNA干擾研究Ran的對(duì)C2C12細(xì)胞體外分化過(guò)程的影響,并進(jìn)一步探究Ran對(duì)分化影響的可能機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)Ran在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá):分別收集分化0 d至5 d的C2C12細(xì)胞蛋白樣,進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,隨著C2C12細(xì)胞分化程度的提高,Ran的表達(dá)量也逐漸升高。(2)Ran在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的分布:通過(guò)對(duì)未分化、分化早期、分化中期和分化晚期的C2C12細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光染色。發(fā)現(xiàn)在未分化的C2C12細(xì)胞中,Ran主要聚集于細(xì)胞核內(nèi);隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng),Ran在細(xì)胞質(zhì)中的濃度升高。(3)Ran過(guò)表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響:構(gòu)建Ran的過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入C2C12細(xì)胞中。Western blot結(jié)果表明,Ran表達(dá)量升高,MyoG和MYH的表達(dá)量也顯著升高;間接免疫熒光染色結(jié)果顯示,C2C12細(xì)胞的肌管融合率明顯升高。Ran表達(dá)量的升高促進(jìn)了C2C12細(xì)胞的分化。(4)Ran的siRNA干擾對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響:Ran的siRNA干擾片段轉(zhuǎn)入C2C12細(xì)胞中。Western blot結(jié)果表明,Ran表達(dá)量降低,MyoG和MYH的表達(dá)量也明顯降低;間接免疫熒光染色結(jié)果顯示,C2C12細(xì)胞的肌管融合率明顯下降。Ran表達(dá)量的降低抑制了C2C12細(xì)胞的分化。(5)TGF-β/Smad信號(hào)通路對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響:C2C12細(xì)胞中添加TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制劑LY2109761。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),磷酸化smad2的含量降低,MyoG和MYH的表達(dá)量也明顯降低。LY2109761的添加抑制了C2C12細(xì)胞的分化。(6)Ran對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響:分別使用Ran的過(guò)表達(dá)載體和siRNA干擾片段來(lái)改變Ran在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)量。Western blot結(jié)果表明,在C2C12細(xì)胞分化第2 d,Ran的表達(dá)量升高,Smad2的蛋白含量也顯著提高;Ran的表達(dá)量降低,Smad2的蛋白含量也明顯降低。而在分化第4 d和第6 d,Smad2的蛋白含量不受Ran表達(dá)量變化的影響。在C2C12細(xì)胞分化的不同時(shí)期,Ran表達(dá)量升高時(shí),磷酸化Smad2的含量均顯著升高;Ran的表達(dá)量下降時(shí),磷酸化Smad2的含量也均顯著降低。Ran的表達(dá)量升高激活TGF-β/Smad信號(hào)通路,Ran的表達(dá)量下降抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路。(7)C2C12細(xì)胞的分化過(guò)程中,Ran與TGF-β/Smad信號(hào)通路之間的關(guān)系:LY2109761處理后,C2C12細(xì)胞中磷酸化Smad2的含量降低,MyoG和MYH的表達(dá)量也顯著降低;LY2109761處理C2C12細(xì)胞并轉(zhuǎn)入Ran過(guò)表達(dá)載體,Ran表達(dá)量的升高,使磷酸化Smad2的含量和MyoG與MYH的表達(dá)量恢復(fù)到不添加抑制劑時(shí)的水平。說(shuō)明Ran可以通過(guò)提高TGF-β/Smad信號(hào)通路中Smad2和磷酸化Smad2的含量促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.2
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文相鄰 Z 線之間的區(qū)域被稱(chēng)為一個(gè)肌節(jié)，包括位于中間部位的暗帶的明帶τI 帶υ，是肌纖維中最小的結(jié)構(gòu)和功能單位[9,10]，見(jiàn)圖 1-2[7

2圖 1-2 肌小節(jié)Fig.1-2 sarcomere維內(nèi)又包含成百上千條與纖維長(zhǎng)軸平行的肌原纖維[11] 肌原纖維不同的肌絲，且粗 細(xì)肌絲之間存在不同程度的重疊所造成的 要由粗肌絲構(gòu)成 粗細(xì)肌絲間的規(guī)律性空間排布，是肌肉收縮的除了粗細(xì)肌絲之外，還有由巨蛋白組成的有彈性的肌絲，他從細(xì)內(nèi)延伸并與 M 線接觸，將粗細(xì)肌絲連接在一起，故也稱(chēng)肌連蛋持粗細(xì)肌絲之間的相對(duì)位置和正常結(jié)構(gòu)外，還能夠制約肌小節(jié)的] 由眾多肌球蛋白分子構(gòu)成，每個(gè)肌球蛋白由 2 條纏繞在一起的重調(diào)節(jié)輕鏈共同組成[7,8]，見(jiàn)圖 1-3[8] 2 條重鏈的尾部相互纏繞形成

圖 1-3 粗細(xì)肌絲的組成Fig.1-3 The composition of thick and thin myofilament由肌動(dòng)蛋白 原肌球蛋白和肌鈣蛋白組成[7,8]，見(jiàn)圖 1-3 許多球形聚合形成兩條長(zhǎng)鏈，相互之間呈雙螺旋式纏繞，構(gòu)成細(xì)肌絲的主干固定在肌原纖維的 Z 線處，另一端插入粗肌絲之間，肌動(dòng)蛋白的單在骨骼肌處于靜息狀態(tài)時(shí)，原肌球蛋白沿肌動(dòng)蛋白雙螺旋的線溝依位于肌動(dòng)蛋白和橫橋之間，將肌動(dòng)蛋白上的橫橋結(jié)合位點(diǎn)遮蓋，阻，產(chǎn)生位阻效應(yīng)[11] 肌鈣蛋白是一種球形的復(fù)合蛋白，由 T C I 亞基負(fù)責(zé)將肌鈣蛋白連接到原肌球蛋白；C 亞基對(duì) Ca2+有很強(qiáng)的親白結(jié)合，使原肌球蛋白保持在肌動(dòng)蛋白雙螺旋線溝上[14,15] 肌的功能骨骼肌運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來(lái)源，而收縮的實(shí)質(zhì)是：肌纖維將 ATP 分解釋放機(jī)械能 這種能量的轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在橫橋與肌動(dòng)蛋白的反復(fù)作用過(guò)維細(xì)胞質(zhì)中的 Ca2+濃度升高后，Ca2+與細(xì)肌絲上的肌鈣蛋白 C 亞基發(fā)生改變，導(dǎo)致肌鈣蛋白 I 亞基與肌動(dòng)蛋白的親和力減弱，原肌球內(nèi)移動(dòng)，解除位阻效應(yīng)[17,18] 此時(shí)，肌動(dòng)蛋白上的橫橋結(jié)合位點(diǎn)暴

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