【摘要】：隨著生活水平的提高,肉類食品在食物構成中所占的比例不斷增加,人們對肉類食品品質的要求也越來越高。目前,國內肉用牛養(yǎng)殖中品種繁多,牛肉產量偏低、品質也參差不齊,牛肉的產量和質量已不能滿足人們的需求。通過遺傳育種的方式獲得高品質的肉牛品種是目前解決這一問題最快速有效的方法。另外,在骨骼肌受到損傷時,潛伏的骨骼肌衛(wèi)星細胞可以通過增殖和分化完成肌纖維的再生,修復損傷的肌肉組織。因此,研究肌肉分化的機理不僅具有巨大的商業(yè)價值,也能夠為醫(yī)學領域內相關疾病的治療提供新思路。Ran(Ras-related nuclear protein,Ran)作為真核生物細胞中含量最為豐富的小G蛋白,參與細胞分裂間期的核質轉運、DNA復制和RNA轉錄;在細胞分裂期參與核膜破裂、紡錘體組裝、染色體分配、核膜裝配和細胞分裂等細胞過程。肌肉分化是肌源性細胞通過增殖、分化和彼此間相互融合成多核肌管,并最終形成具有收縮功能的肌纖維的過程。本研究以小鼠C2C12成肌細胞為研究對象,通過Ran的過表達和siRNA干擾研究Ran的對C2C12細胞體外分化過程的影響,并進一步探究Ran對分化影響的可能機制。具體實驗內容及結果如下:(1)Ran在C2C12細胞分化過程中的表達:分別收集分化0 d至5 d的C2C12細胞蛋白樣,進行Western blot實驗。結果顯示,隨著C2C12細胞分化程度的提高,Ran的表達量也逐漸升高。(2)Ran在C2C12細胞分化過程中的分布:通過對未分化、分化早期、分化中期和分化晚期的C2C12細胞進行間接免疫熒光染色。發(fā)現(xiàn)在未分化的C2C12細胞中,Ran主要聚集于細胞核內;隨著分化時間的延長,Ran在細胞質中的濃度升高。(3)Ran過表達對C2C12細胞分化的影響:構建Ran的過表達載體,轉入C2C12細胞中。Western blot結果表明,Ran表達量升高,MyoG和MYH的表達量也顯著升高;間接免疫熒光染色結果顯示,C2C12細胞的肌管融合率明顯升高。Ran表達量的升高促進了C2C12細胞的分化。(4)Ran的siRNA干擾對C2C12細胞分化的影響:Ran的siRNA干擾片段轉入C2C12細胞中。Western blot結果表明,Ran表達量降低,MyoG和MYH的表達量也明顯降低;間接免疫熒光染色結果顯示,C2C12細胞的肌管融合率明顯下降。Ran表達量的降低抑制了C2C12細胞的分化。(5)TGF-β/Smad信號通路對C2C12細胞分化的影響:C2C12細胞中添加TGF-β/Smad信號通路抑制劑LY2109761。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),磷酸化smad2的含量降低,MyoG和MYH的表達量也明顯降低。LY2109761的添加抑制了C2C12細胞的分化。(6)Ran對TGF-β/Smad信號通路的影響:分別使用Ran的過表達載體和siRNA干擾片段來改變Ran在C2C12細胞分化過程中的表達量。Western blot結果表明,在C2C12細胞分化第2 d,Ran的表達量升高,Smad2的蛋白含量也顯著提高;Ran的表達量降低,Smad2的蛋白含量也明顯降低。而在分化第4 d和第6 d,Smad2的蛋白含量不受Ran表達量變化的影響。在C2C12細胞分化的不同時期,Ran表達量升高時,磷酸化Smad2的含量均顯著升高;Ran的表達量下降時,磷酸化Smad2的含量也均顯著降低。Ran的表達量升高激活TGF-β/Smad信號通路,Ran的表達量下降抑制TGF-β/Smad信號通路。(7)C2C12細胞的分化過程中,Ran與TGF-β/Smad信號通路之間的關系:LY2109761處理后,C2C12細胞中磷酸化Smad2的含量降低,MyoG和MYH的表達量也顯著降低;LY2109761處理C2C12細胞并轉入Ran過表達載體,Ran表達量的升高,使磷酸化Smad2的含量和MyoG與MYH的表達量恢復到不添加抑制劑時的水平。說明Ran可以通過提高TGF-β/Smad信號通路中Smad2和磷酸化Smad2的含量促進C2C12細胞分化。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.2
【圖文】：

東北農業(yè)大學農學碩士學位論文相鄰 Z 線之間的區(qū)域被稱為一個肌節(jié)，包括位于中間部位的暗帶的明帶τI 帶υ，是肌纖維中最小的結構和功能單位[9,10]，見圖 1-2[7

2圖 1-2 肌小節(jié)Fig.1-2 sarcomere維內又包含成百上千條與纖維長軸平行的肌原纖維[11] 肌原纖維不同的肌絲，且粗 細肌絲之間存在不同程度的重疊所造成的 要由粗肌絲構成 粗細肌絲間的規(guī)律性空間排布，是肌肉收縮的除了粗細肌絲之外，還有由巨蛋白組成的有彈性的肌絲，他從細內延伸并與 M 線接觸，將粗細肌絲連接在一起，故也稱肌連蛋持粗細肌絲之間的相對位置和正常結構外，還能夠制約肌小節(jié)的] 由眾多肌球蛋白分子構成，每個肌球蛋白由 2 條纏繞在一起的重調節(jié)輕鏈共同組成[7,8]，見圖 1-3[8] 2 條重鏈的尾部相互纏繞形成

圖 1-3 粗細肌絲的組成Fig.1-3 The composition of thick and thin myofilament由肌動蛋白 原肌球蛋白和肌鈣蛋白組成[7,8]，見圖 1-3 許多球形聚合形成兩條長鏈，相互之間呈雙螺旋式纏繞，構成細肌絲的主干固定在肌原纖維的 Z 線處，另一端插入粗肌絲之間，肌動蛋白的單在骨骼肌處于靜息狀態(tài)時，原肌球蛋白沿肌動蛋白雙螺旋的線溝依位于肌動蛋白和橫橋之間，將肌動蛋白上的橫橋結合位點遮蓋，阻，產生位阻效應[11] 肌鈣蛋白是一種球形的復合蛋白，由 T C I 亞基負責將肌鈣蛋白連接到原肌球蛋白；C 亞基對 Ca2+有很強的親白結合，使原肌球蛋白保持在肌動蛋白雙螺旋線溝上[14,15] 肌的功能骨骼肌運動的動力來源，而收縮的實質是：肌纖維將 ATP 分解釋放機械能 這種能量的轉換主要發(fā)生在橫橋與肌動蛋白的反復作用過維細胞質中的 Ca2+濃度升高后，Ca2+與細肌絲上的肌鈣蛋白 C 亞基發(fā)生改變，導致肌鈣蛋白 I 亞基與肌動蛋白的親和力減弱，原肌球內移動，解除位阻效應[17,18] 此時，肌動蛋白上的橫橋結合位點暴

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本文編號：2789918