發(fā)布時間：2020-08-09 16:07

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells BMSCs)是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種成體多能祖細胞,能夠支持造血干細胞的生長,被分離后可在體外進行擴增而不會喪失多能性,在特定條件下還能分化成成骨,軟骨,脂肪,肌肉,神經(jīng),內(nèi)皮等多種間充質(zhì)譜系組織,目前被廣泛用于再生醫(yī)學、組織工程、禽類發(fā)育生物學以及生產(chǎn)嵌合體等研究。目前有關(guān)BMSCs的研究多集中于人、鼠、兔和羊等哺乳動物,鮮有雞BMSCs研究的相關(guān)報道。所以,雞BMSCs的分離純化以及體外培養(yǎng)體系的建立勢在必行。本研究旨在建立雞BMSCs分離培養(yǎng)體系,為進一步利用BMSCs生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞以及細胞水平上的基因編輯奠定基礎(chǔ)。本試驗選擇了 1-15日齡的廣西黃羽雞作為試驗材料。首先無菌分離出雞的股骨和脛骨并剪除股骨和脛骨的兩骨骺端,然后用D-PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12)沖洗出全部骨髓,隨后通過Ficoo1400密度梯度離心法對BMSCs進行初步純化,最后在傳代培養(yǎng)過程中通過差速消化差速貼壁的方法對BMSCs進行再次純化。當分離培養(yǎng)的BMSCs純度達到90%以上時,通過形態(tài)學觀察、增殖動力學檢測、集落形成能力試驗、組織化學檢測、RT-PCR分析對其初步鑒定,之后再通過體外分化試驗和嵌合體試驗對其進行進一步鑒定。其中組織化學檢測主要運用了糖原染色(PAS)、堿性磷酸酶檢測(ALP)、細胞表面標志物的免疫熒光檢測(IF)、油紅O染色等方法;RT-PCR分析試驗則是通過設(shè)計相關(guān)引物來檢測細胞是否表達BMSCs細胞表面的幾種標志物基因,和控制多能性的幾種轉(zhuǎn)錄因子;體外分化試驗則是對BMSCs進行了成脂細胞和成骨細胞定向誘導分化,然后通過組織化學檢測和RT-PCR分析來驗證分化結(jié)果;嵌合體試驗是通過將EDU標記的BMSCs注射到孵育53小時的雞胚背主動脈中,然后通過換殼培養(yǎng)繼續(xù)孵育,在第7天和11天時檢測雞胚中的EDU信號的方法進行。細胞形態(tài)學觀察表明本研究所分離的細胞接種到細胞培養(yǎng)皿后,會在12-24h貼壁,細胞形態(tài)會從圓形逐漸變?yōu)榧忓N形、橢圓形、扁平形等多種形狀。在用差速消化差速貼壁的方法對其進行進一步純化的過程中,細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一并表現(xiàn)為典型的成纖維狀。增殖動力學實驗結(jié)果表明本研究所分離的細胞在培養(yǎng)過程中其生長曲線呈典型的“S”型,并隨著細胞代數(shù)的增加,其倍增時間逐漸延長。集落形成能力試驗說明本研究所分離的細胞有形成集落的潛力,并且隨著細胞接種量的增多,形成集落的數(shù)量增多。組織化學檢測結(jié)果為:糖原染色陽性,堿性磷酸酶檢測陰性,細胞表面標志物CD29、CD44以及波形蛋白免疫熒光染色陽性,造血干細胞表面標志物CD34、CD45免疫熒光染色陰性。RT-PCR分析結(jié)果顯示BMSCs表達細胞表面標志物基因CD29、CD44、CD71,以及控制細胞多能性的轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Myc、Nanog、PouV。體外分化試驗表明本研究所分離的細胞具有多向分化的潛能,在特定條件下可以分化成成骨細胞和成脂細胞。嵌合體試驗結(jié)果表明我們所分離的細胞有潛力成為制備嵌合體的有力工具。本研究所分離的廣西黃羽雞來源的BMSCs具有易于分離、擴增、免疫原性低以及體外培養(yǎng)時能長期生成并維持多系分化的潛能的特點。有希望運用于再生醫(yī)學、細胞移植治療、禽類發(fā)育生物學和轉(zhuǎn)基因雞的制備等方面。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.1
【圖文】：

Ａ、Ｂ：分離后接種第５天的ＢＭＳＣｓ；邋Ｃ、Ｄ：分離后接種第１１天的ＢＭＳＣｓ邋（標尺：逡逑１００邋Ｕ邋ｍ）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＰＯ邋ｐｈａｓｅ邋ｓｅｐａｒａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｇｒａｄｉｅｎｔ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ逡逑Ａ，邋Ｂ：邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋５ｔｈ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；邋Ｃ，邋Ｄ：邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｏｎ逡逑ｔｈｅ邋１１ｔｈ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋（ｓｃａｌｅ：邋１００邋＼ｘｍ）逡逑２．３．２差速貼壁培養(yǎng)法純化與培養(yǎng)ＢＭＳＣｓ結(jié)果逡逑根據(jù)ＢＭＳＣｓ與其他細胞貼壁能力、沉降速度的差異，通過控制消化時間和接逡逑種后首次換液時間對其進行進一步的純化。按照本實驗所建立的差速貼壁的純化逡逑方法，ＢＭＳＣｓ逐漸得到純化，表現(xiàn)為細胞形態(tài)的日漸統(tǒng)一。ＰＩ、Ｐ２時期在培養(yǎng)皿逡逑中還可看到大量的雜細胞，到Ｐ３時就可看到純度約在９０°／。以上的ＢＭＳＣｓ。在本實逡逑驗所建立的培養(yǎng)體系中ＢＭＳＣｓ表現(xiàn)出良好的生長狀況，細胞呈典型的成纖維狀，逡逑細胞體積大，邊緣光亮，細胞形態(tài)穩(wěn)定（圖２－２）。逡逑

３．邋５ｃｍ的細胞培養(yǎng)皿中分別接種１０００和１００００個細胞時，經(jīng)過７天的培養(yǎng)，集逡逑落逐漸形成，在倒置顯微鏡下觀察雞ＭＳＣ分別形成２５±８和７０±邋１０個直徑大于逡逑３ｍｍ的可見集落（圖２－３）。逡逑：

本文編號：2787348