【摘要】：腸道病毒(enterovirus,EV)為小RNA病毒科腸道病毒屬的成員,是導(dǎo)致人類與動(dòng)物的消化、神經(jīng)和呼吸系統(tǒng)疫病的重要病原體。根據(jù)病毒最新分類,腸道病毒屬分為12個(gè)腸道病毒種和3個(gè)鼻病毒種。A、B、C、D種腸道病毒主要感染人,E種和F種主要感染牛,G種主要感染豬,H種和J種主要感染靈長類動(dòng)物。I、K、L種腸道病毒為新的腸道病毒種。本實(shí)驗(yàn)室于2014年從吉林省某規(guī)�；B(yǎng)羊場暴發(fā)的臨床上以呼吸困難、嚴(yán)重腹瀉、發(fā)病率和致死率高達(dá)50-80%為特征的病羊體內(nèi)分離到山羊腸道病毒CEV-JL14,首次確定了國內(nèi)羊群存在腸道病毒感染。由于羊腸道病毒感染為國內(nèi)新發(fā)疫病,有關(guān)本病的診斷、流行病學(xué)及病毒的致病機(jī)理等方面缺乏研究。本研究以分離的山羊腸道病毒CEV-JL14實(shí)驗(yàn)感染乳鼠,建立了羊腸道病毒感染小鼠模型。應(yīng)用病毒感染不同品系的小鼠,確定出ICR小鼠為羊腸道病毒易感小鼠品系。同時(shí)以2×10~8 TCID_(50)病毒液,分別通過腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途徑接種ICR乳鼠,發(fā)現(xiàn)各種接種途徑均可感染小鼠。以不同劑量病毒感染乳鼠,確定出羊腸道病毒CEV-JL14感染小鼠的最低感染劑量為2×10~6 TCID_(50)。應(yīng)用RT-PCR方法,檢測(cè)CEV-JL14病毒感染小鼠后不同時(shí)間的器官組織,確定出ICR小鼠感染病毒后帶毒時(shí)間至少可持續(xù)16天。組織病理學(xué)檢查顯示,病毒感染引起乳鼠出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)變化。心肌間質(zhì)水腫,心肌細(xì)胞變性,且局部有淋巴細(xì)胞浸潤。肝細(xì)胞腫脹,發(fā)生顆粒變性和水泡變性,肝臟組織中有大量的淋巴細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤。脾臟淋巴細(xì)胞增多,細(xì)胞壞死,紅髓區(qū)有炎性細(xì)胞聚集。肺臟肺泡壁增厚,炎性細(xì)胞浸潤,有明顯的出血、淤血。腎臟腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性,有淋巴細(xì)胞浸潤。腸絨毛脫落,小腸絨毛空泡變性,腸粘膜上皮細(xì)胞腫脹。腦神經(jīng)元存在不同程度空泡變性,神經(jīng)元變性壞死,數(shù)量減少,腦室脈絡(luò)叢大量淋巴細(xì)胞浸潤。肌肉局部間質(zhì)水腫,大量淋巴細(xì)胞浸潤,少量纖維組織增生。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法確定感染小鼠組織中的病毒抗原,發(fā)現(xiàn)感染小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、腦、肌肉組織中均能檢測(cè)到羊腸道病毒病毒抗原,其中病毒抗原在心肌、肌肉、肝臟、肺臟中明顯高于其他組織。綜上所述,本研究成功建立了羊腸道病毒感染小鼠模型,確定出病毒的易感小鼠品系,病毒感染小鼠的途徑與最低劑量,病毒的組織親嗜性。該結(jié)果為進(jìn)一步研究羊腸道病毒的致病機(jī)理、病毒感染誘導(dǎo)的免疫機(jī)理及疫苗研制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

圖 1.1 病毒基因組結(jié)構(gòu)[18]1.3.2 腸道病毒基因編碼的蛋白及其功能1.3.2.1 VPg 蛋白及其功能腸道病毒屬的成員都含有一個(gè)大的 ORF，編碼一個(gè)大約為 2178-2332 個(gè)氨基酸的前體多聚蛋白。翻譯蛋白的時(shí)候，多聚蛋白不斷被水解成小片段蛋白。5’UTR的 IRES 是一個(gè)順式作用元件，形成二級(jí)的 RNA 結(jié)構(gòu)，并且也形成三級(jí)的 RNA結(jié)構(gòu)，并且病毒的 RNA 能夠借用細(xì)胞翻譯裝置[19]。一個(gè)合理的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)的生成，對(duì)由小 RNA 病毒 IRES 啟動(dòng)的內(nèi)部翻譯來說是至關(guān)重要的[26]。IRES 介導(dǎo)的病毒翻譯，與 IRES 識(shí)別相關(guān)的翻譯因子有關(guān)。IRES 依賴性翻譯，需要大量的 ITAFs 因子來招募核糖體并啟動(dòng)翻譯。這些蛋白可以作為IRES 的伴侶，結(jié)合在 RNA 的多個(gè)域，并且穩(wěn)定整個(gè) IRES 的結(jié)構(gòu)，這對(duì)結(jié)合的翻譯因子來說很合適。很多報(bào)道表示 ITAFs 的活動(dòng)是依賴于它們的亞細(xì)胞定位[26,

圖 2.1 CEV 感染乳鼠品系的確定000 DNA Marker；1-3：分別為接種病毒的 ICR、BALB樣品；4-6：分別為接種 DMEM 的 ICR、BALB/c 和 K7：陽性對(duì)照；8：陰性對(duì)照。EV 易感乳鼠的途徑確定 CEV 感染途徑，我們以 5 種不同感染方式（腹腔注射注射、灌胃、滴鼻）給乳鼠接種 2 ×108TCID50病毒液，組織中 CEV 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖 2.2 所示，五種途徑接種乳小與預(yù)期條帶大小一致，經(jīng)過核苷酸序列測(cè)定，確定為 CEV-現(xiàn)腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途徑接種的乳仍然選取皮下注射進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2.2 CEV 乳鼠感染途徑的確定M：DL2000 DNA Marker；1-5：分別為腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途徑接種病毒液的乳鼠組織樣品；6-10：分別為腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途徑接種 DMEM 的乳鼠組織樣品；11：陽性對(duì)照；12：陰性對(duì)照。2.3.4 CEV 易感乳鼠的最低感染劑量為了確定 CEV 易感乳鼠最低感染劑量，選取 4 窩 3 日齡 ICR 乳鼠，分別命名為 A、B、C 和 D 組，對(duì) A、B、C 組每只乳鼠分別以頸部皮下注射 2×104TCID50、2×106TCID50、2×108TCID50感染劑量的病毒液，對(duì) D 組每只乳鼠注射相同體積的 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液。接種 5 天后處死各組的乳鼠，收集各組織、器官并提取乳鼠組織 RNA，再通過 RT-PCR 檢測(cè) CEV 基因片段，結(jié)果如圖 2.3 所示，乳鼠感染劑量為 2×104TCID50病毒時(shí)，并未出現(xiàn)目的條帶，當(dāng)感染劑量分別達(dá)到 2×106

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 邢澤黎;朱利塞;王新平;李蘇靖;郭昌明;楊麗;;從吉林省肉牛場新發(fā)疫病分離出E種腸道病毒[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年03期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 朱利塞;E種腸道病毒HY12準(zhǔn)種與進(jìn)化及VP1基因突變對(duì)病毒復(fù)制的影響[D];吉林大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2786621