【摘要】：水牛是中國(guó)南方重要家畜之一,由于其繁殖效率低下及優(yōu)秀種質(zhì)資源缺乏,嚴(yán)重制約了水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。精原干細(xì)胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)是動(dòng)物種質(zhì)資源改良和新品種培育最具潛力的種子細(xì)胞之一,已成為當(dāng)前動(dòng)物繁殖學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前小鼠SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)已較成熟,但是水牛相關(guān)研究較少,已知的SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)尚不能滿足水牛SSCs體外長(zhǎng)期培養(yǎng)需求。本研究擬通過探索影響水牛精原干細(xì)胞富集及體外增殖的相關(guān)因素,為優(yōu)化當(dāng)前水牛SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究成果如下:1.探討了影響水牛支持細(xì)胞(sertoli)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備的相關(guān)因素。水牛睪丸細(xì)胞懸液經(jīng)差異貼壁6 h,對(duì)已貼壁細(xì)胞用sertoli細(xì)胞特異性抗體WT1免疫熒光染色并計(jì)數(shù),其純度可達(dá)95%以上。以不同濃度絲裂霉素C處理sertoli細(xì)胞,結(jié)果顯示,3.0 μg/mL絲裂霉素C處理組細(xì)胞增殖顯著低于對(duì)照組和1.5μg/ml裂霉素C處理組,但與其它處理組無顯著差異,所以制備sertoli飼養(yǎng)層細(xì)胞的絲裂霉素C處理濃度以3.0 μg/ml為宜。收集不同代sertoli細(xì)胞(0-10代),采用qRT-PCR分析sertoli細(xì)胞特異表達(dá)基因,結(jié)果顯示,P6、P7和P8代的sertoli細(xì)胞中GDNF表達(dá)量顯著高于其它代細(xì)胞,而P7和P8代的SCF與FGF2表達(dá)量顯著高于其它代細(xì)胞。2.觀察了不同年齡水牛SSCs相關(guān)基因的表達(dá)狀況。利用DDX4抗體與PGP9.5抗體對(duì)水牛睪丸組織SSCs進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)SSCs主要分布于曲細(xì)精管基底膜附近。采用qRT-PCR分析青春期前和成牛水牛睪丸細(xì)胞懸液SSCs相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果顯示青春期前睪丸細(xì)胞懸液Nanos2表達(dá)量顯著高于成年水牛。水牛睪丸細(xì)胞懸液經(jīng)明膠和鼠尾膠原蛋白差異貼壁富集SSCs細(xì)胞,結(jié)果顯示富集后的細(xì)胞PGP9.5陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于未差異貼壁組,并且經(jīng)差異貼壁PGP9.5陽性細(xì)胞數(shù)量是未差異貼壁細(xì)胞的2.3倍。3.探討了褪黑激素(Melatonin)和CHIR-99021(簡(jiǎn)稱 CHIR)對(duì)SSCs體外增殖的影響。在IMDM培養(yǎng)系統(tǒng)中分別添加不同濃度褪黑激素或CHIR,SSCs經(jīng)培養(yǎng)4天后傳代,繼續(xù)培養(yǎng)4天后,收集細(xì)胞,對(duì)SSCs干性及生殖相關(guān)基因(PLZF,DDX4,NANOS2)、分化相關(guān)基因(DMRT1,REC8,DAZL)、氧化相關(guān)基因(CAT,SOD3)和細(xì)胞增殖相關(guān)基因(CCND1,CCNE1)進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,10-6MMelatonin處理組SSCs中PLZF、DDX4、SOD3表達(dá)量顯著高于對(duì)照組;而DMRT1和REC8顯著下調(diào);CCND1基因表達(dá)在各組中無顯著差異。10-6M Melatonin處理組與對(duì)照組的DDX4和PGP9.5陽性細(xì)胞數(shù)無顯著差異。添加10 μM CHIR處理組SSCs中PLZF表達(dá)量極顯著高于其它組,與對(duì)照組相比,NANOS2、CCND1、CCNE1表達(dá)量顯著上調(diào);DAZL、DMRT1、CAT和SOD3均顯著下調(diào)。10μMCHIR處理組DDX4和PGP9.5陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組,10 μM CHIR處理組陽性細(xì)胞數(shù)增加了1.7倍。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823.83
【圖文】：

丸曲細(xì)精管緊靠基底膜附近，但是在青春期前水牛睪丸中ＷＴ１陽性細(xì)胞的密度逡逑遠(yuǎn)大于成年水牛的密度，這與成年水牛已經(jīng)進(jìn)行精子發(fā)生有密切聯(lián)系，其與支持逡逑細(xì)胞特性是－致的（圖１－２）。逡逑ｗＳＫＳｓｍＳＢｍ逡逑ｉｍｍｍｍＫｍ邋■ＨＨＨＩ邋■ｗＢＩ逡逑圖１－２：青春期前與成年水牛睪丸組織免疫組織化學(xué)染色；比例尺：２００ｐｍ逡逑Ｆｉｇｌ－２：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔｙ邋ａｎｄ邋ａｄｕｌｔ邋ｂｕｆｆａｌｏ，邋ｓｃａｌｅ逡逑ｂａｒ：邋２００｜．ｕｎ逡逑水牛睪丸細(xì)胞懸液經(jīng)明膠差速貼壁６邋ｈ，對(duì)己經(jīng)貼壁細(xì)胞經(jīng)ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞特異逡逑性抗體ＷＴ１免疫熒光染色，ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞純度達(dá)到９５％以上（圖１－３）。所以認(rèn)為逡逑從水牛睪丸細(xì)胞懸液經(jīng)差速貼壁所得到的細(xì)胞為ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞，將為下一步的實(shí)驗(yàn)逡逑提供支持。逡逑ＭＢＢｒｎＳ逡逑ＶＳＳＳＢＳ邐ＨＨＩ逡逑圖１－３：支持細(xì)胞特異性抗體ＷＴ免疫細(xì)胞染色；比例尺：２００ｐｍ逡逑２２逡逑

ｍｍ逡逑胰酶消化前曲細(xì)精管邐胰＿消化所得水Ｈ丸細(xì)胞總：液逡逑圖２－２：胰酶消化曲細(xì)精管前后；比例尺：２０（Ｈｉｍ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｙｐｓｉｎ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅｍｉｎｉｆｅｒｏｕｓ邋ｔｕｂｕｌｅｓ；邋ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋２００（ｉｍ逡逑通過ＩＨＣ對(duì)水牛睪丸內(nèi)ＳＳＣｓ進(jìn)行了定位，我們希望對(duì)青春期前－成年水牛逡逑睪丸細(xì)胞懸液在基因水平上進(jìn)行分析。ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果顯示，ＳＳＣｓ特異性基因逡逑Ｎａｎ0Ｓ２在青春期前的表達(dá)量顯著高于成年水牛（圖２－３邋Ａ）；而生殖系細(xì)胞標(biāo)記逡逑基因ＤＤＸ４在成年水牛睪丸懸液細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于青春期前水牛（圖２－３逡逑Ｂ）；干細(xì)胞特異性基因Ｏｃｔ４在兩種細(xì)胞中沒有顯著差異（圖２－３邋Ｃ）。逡逑ＡＢＣ逡逑ＮＡＮＯＳ２邐Ｄ０Ｘ４邐０ＣＴ４逡逑0邐９逡逑｜邐１５邐｜邐１�。埃边姡哌姡姡睿箦义希椋哼姡。海疲欤椋戾义希卞澹叔澹�，－ｊ邐Ｉ邋Ｊ邐Ｉ邋Ｊ逡逑ａ邋＾邋＾邋，逡逑圖２－３：青春期前－成年水牛睪丸組織細(xì)胞懸液不同基因ｍＲＮＡ表達(dá)量；Ａ．Ｎａｎｏｓ２基因逡逑Ｂ．ＤＤＸ４基因Ｃ．ＯＣＴ４基因逡逑Ｆｉｇ邋２－３：邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔａｌ－ａｄｕｌｔ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑ｃｅｌｌ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ；邋Ａ．邋Ｎａｎｏｓ２邋ｇｅｎｅ邋Ｂ．邋ＤＤＸ４邋ｇｅｎｅ邋Ｃ．邋ＯＣＴ４邋ｇｅｎｅ逡逑２．２＿３邋７＞Ｃ牛ＳＳＣｓ的富集逡逑將制備好的睪丸細(xì)胞懸液離心

將水牛睪丸細(xì)胞懸液與經(jīng)明膠和鼠尾膠原蛋白差異貼壁收集的漂浮細(xì)胞以逡逑相同細(xì)胞密度接種到飼養(yǎng)層上，使用精原干細(xì)胞特異性抗體ＰＧＰ９．５進(jìn)行免疫熒逡逑光染色并統(tǒng)計(jì)分析（圖２－５邋Ａ、Ｂ），結(jié)果顯示，經(jīng)差異貼壁精原千細(xì)胞含量是未逡逑差異貼壁的２．３倍，顯著高于未差異貼壁精原干細(xì)胞量（圖２－５邋Ｃ）。逡逑３３逡逑

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本文編號(hào)：2785624