【摘要】：抗生素對畜禽動物具有促進生長和防治疾病的功效,但是近年來由于抗生素的不合理使用導致抗生素殘留以及耐藥細菌的不斷出現(xiàn)等隱患,并且隨著消費者對“無抗”產(chǎn)品需求的增加,因此研發(fā)安全、高效的新型飼用抗生素替代產(chǎn)品成為當前我國畜禽業(yè)健康養(yǎng)殖的研究熱點。抗菌肽作為抗生素的替代品具有廣譜抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點,其中,從非洲爪蟾(Xenopus laevis)皮膚中分離到的爪蟾素(Magainin II)以及從天蠶(Bombyx mori)中分離得到的天蠶素B(Cecropin B)是抗菌肽中公認的能夠提高細菌性疾病抵抗力的良好候選分子之一。除了天然的抗菌肽之外,許多重組表達的抗菌肽在穩(wěn)定性和特異性方面更具優(yōu)勢,但目前為止關于利用食藥用真菌蛹蟲草(Cordyceps militaris)作為抗菌肽的重組表達載體方面的研究未見報道。本研究首先利用蛹蟲草菌絲體作為受體系統(tǒng),將Magainin II-Cecropin B(Mag II-CB)融合抗菌肽基因以及Cecropin B(CB)基因分別轉(zhuǎn)入到蛹蟲草菌絲體中進行高效表達;并利用Ni-NTA親和層析法純化所獲得的重組抗菌肽Mag II-CB和CB,對其體外抑菌活性和抗菌機制進行了初步驗證;進一步通過利用感染大腸桿菌ATCC 25922的BALB/c小鼠為模型,分別分析驗證了純化的重組抗菌肽和低溫凍干的轉(zhuǎn)抗菌肽基因蛹蟲草菌絲的功能活性。結(jié)果顯示,利用蛹蟲草菌絲體表達的重組抗菌肽以及所獲得的轉(zhuǎn)抗菌肽基因蛹蟲草菌絲都具有高效的抑菌活性和免疫活性。具體研究結(jié)果如下:1、蛹蟲草原生質(zhì)體提取最佳條件為:菌齡4 d、酶解溫度34℃以及酶解時間4 h,蛹蟲草原生質(zhì)體的提取量平均達到10~7-10~8個/mL。確定蛹蟲草原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)基為含0.8 M甘露醇的PDA培養(yǎng)基,潮霉素抗性的最小抑制濃度為650 mg/L。確定根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件為:誘導劑乙酰丁香酮濃度200μM、共培養(yǎng)時間2 d以及根瘤農(nóng)桿菌與蛹蟲草原生質(zhì)體的個數(shù)比為10~7/10~5。2、構(gòu)建含雜合抗菌肽Mag II-CB基因的真菌表達載體pCB130-Mag II-CB以及只含CB基因的真菌表達載體pCB130-CB,并利用根瘤農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化蛹蟲草原生質(zhì)體,通過PCR以及Western Blot檢測分別獲得6株轉(zhuǎn)Mag II-CB基因的蛹蟲草菌株和5株轉(zhuǎn)CB基因的蛹蟲草菌株,ELISA測定Mag II-CB和CB的產(chǎn)量約占總可溶性蛋白的0.938±0.072‰和0.705±0.054‰。3、利用Ni-NTA親和層析法純化含組氨酸標簽的重組抗菌肽Mag II-CB和CB,ELISA測定Mag II-CB和CB的純化率為82.6%和80.4%。通過平板打孔法以及最小抑菌濃度分析測定重組抗菌肽Mag II-CB在抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌方面比重組抗菌肽CB表現(xiàn)出更有效的抑菌活性。此外,觀察分析重組抗菌肽對大腸桿菌細胞膜滲透性以及利用掃描電鏡觀察其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用,結(jié)果顯示重組抗菌肽Mag II-CB和CB可通過胞外抑菌機制作用于細菌的細胞膜,最終導致菌體死亡,并且重組抗菌肽Mag II-CB顯示出更強的抑菌作用。4、在獲得純化的重組抗菌肽基礎上,以感染大腸桿菌ATCC 25922的BALB/c小鼠為試驗動物模型,確定大腸桿菌ATCC 25922的最小致死劑量以及小鼠體內(nèi)重組抗菌肽的最小保護濃度分別為1×10~9 CFU/mL和8 mg/kg,進一步分析發(fā)現(xiàn)重組抗菌肽能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌群,改善小鼠腸道絨毛損傷,緩解染菌小鼠的腸道絨毛長度、隱窩深度以及絨毛長度與隱窩深度比值的降低。同時發(fā)現(xiàn)重組雜合抗菌肽Mag II-CB能夠明顯地提高小鼠腸道中緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的表達水平,降低因腹腔注射大腸桿菌后引起的血漿中IgA、IgM、IgG以及回腸中sIgA水平的增加,此外,能夠降低促炎細胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA表達水平,增加抗炎細胞因子IL-10的mRNA表達水平。5、通過給感染大腸桿菌ATCC 25922的BALB/c小鼠飼喂轉(zhuǎn)抗菌肽基因蛹蟲草菌絲進一步研究轉(zhuǎn)基因蛹蟲草菌絲功能活性,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因蛹蟲草菌絲能夠通過口服的方式來調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的變化,并且有效地改善了小鼠腸粘膜以及腸道絨毛損傷情況,維持了腸道形態(tài)的完整性。此外,轉(zhuǎn)Mag II-CB基因蛹蟲草菌絲能夠提高緊密連接蛋白的表達水平,降低小鼠血漿中IgA、IgM、IgG以及回腸中sIgA的水平,并且降低促炎細胞因子IL-6和TNF-α的mRNA表達水平,增加抗炎細胞因子IL-10的mRNA表達水平,與純化的重組抗菌肽研究結(jié)果相一致。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S816.7
【圖文】：

圖 1.1 抗菌肽的抑菌作用機制[4]Fig.1.1 Mechanisms of action of antimicrobial peptides1.2.1 抗菌肽的胞外抑菌機制抗菌肽胞外抑菌機制主要分為作用于細菌細胞膜以及非膜性的外部靶點兩種方式。

符合后續(xù)實驗要求，因此采用菌齡為 4 d、酶解溫度 34 ℃、酶解時間 4 h的最佳條件來制備蛹蟲草原生質(zhì)體。圖2.1 菌齡、酶解溫度和酶解時間對蛹蟲草原生質(zhì)體提取的影響Fig.2.1 Effects of age, temperature and enzymatic hydrolysis time on protoplast extraction of Cordycepsmilitaris2.2.2 蛹蟲草原生質(zhì)體的制備及其活性檢測按照所篩選的最優(yōu)條件對液體發(fā)酵的蛹蟲草菌球進行蛹蟲草原生質(zhì)體的制備，顯微鏡下觀察所制備的原生質(zhì)體狀態(tài)良好（圖 2.2），并進行 FDA 染色檢測原生質(zhì)體的活性，熒光倒置顯微鏡下原生質(zhì)體的活性良好（圖 2.3），并且經(jīng)統(tǒng)計，蛹蟲草原生質(zhì)體的數(shù)量達到 107-108個/mL，原生質(zhì)體活性高達 90%以上。

22圖2.2 顯微鏡下觀察蛹蟲草原生質(zhì)體的狀態(tài)Fig.2.2 Status of C. militaris protoplasts observing under microscope圖 2.3 熒光顯微鏡下觀察 FDA 染色后蛹蟲草原生質(zhì)體的狀態(tài)Fig.2.3 Status of FDA-stained C. militaris protoplasts observing under fluorescence microscope2.2.3 蛹蟲草原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的確定通過在 PDA、MYG 及纖維二糖培養(yǎng)基三種不同的再生培養(yǎng)基上涂布同等數(shù)量的原生質(zhì)體，25 ℃避光培養(yǎng) 7 d 后，對蛹蟲草原生質(zhì)體的再生情況進行觀察。如圖 2.4 所示，原生質(zhì)體再生情況最好的是在含 0.8 M 甘露醇的 PDA 培養(yǎng)基上（圖 2.4-A），其次為 MYG培養(yǎng)基（圖 2.4-B），最差的是在纖維二糖培養(yǎng)基上（圖 2.4-C）。

【參考文獻】

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本文編號：2785553