【摘要】：Src同源區(qū)2(SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶2(Shp-2)是一種非受體酪氨酸磷酸酶,在各種脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中普遍表達(dá),參與細(xì)胞的分化等多種生物學(xué)功能的調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。作為原癌基因PTPN11編碼的酪氨酸磷酸酶,Shp-2的表達(dá)及其活性改變已被證明與造血細(xì)胞的惡性增生、兒童白血病及多種人的惡性腫瘤疾病有關(guān)。然Shp-2在禽類疾病中所起的作用研究鮮見報(bào)道。為探究雞源Shp-2功能及其在相關(guān)疾病中作用,本研究在克隆、表達(dá)了雞源Shp-2基因的基礎(chǔ)上,研制出了針對雞Shp-2的特異性單克隆抗體,且利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了穩(wěn)定敲除Shp-2的雞肝細(xì)胞系。1、雞Shp-2基因克隆及表達(dá)為獲得用于制備抗雞Shp-2單克隆抗體的免疫原和篩選抗原,本研究將Shp-2基因克隆至線性化載體pGEX-6p-1和pcDNA3.1上,成功構(gòu)建了 Shp-2原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-Shp-2 及真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-Shp-2。將獲得的陽性重組子pGEX-6P-1-Shp-2轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)GST-Shp-2蛋白可以以包涵體形式以及可溶性形式表達(dá)。Western blot分析證明重組蛋白GST-Shp-2具有良好的抗原反應(yīng)性。利用GST瓊脂糖凝膠柱純化了可溶性形式表達(dá)的GST-Shp-2蛋白,為后續(xù)小鼠免疫及抗雞Shp-2單克隆抗體的制備提供了生物材料,奠定了基礎(chǔ)。2、抗雞Shp-2單克隆抗體的制備及特性鑒定為獲得抗雞Shp-2單克隆抗體,本研究將純化的GST-Shp-2免疫BALB/c小鼠,以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Shp-2的DF-1細(xì)胞為篩選抗原,通過IFA篩選出兩株能夠分泌出抗雞Shp-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為3A10和3G12,亞類均為IgG1,輕鏈均為κ鏈。3A10和3G12的IFA熒光效價(jià)測定均為1:12800,且Western blot試驗(yàn)表明這兩株單抗與內(nèi)源性和外源性表達(dá)的Shp-2均能發(fā)生特異性反應(yīng)。通過對單抗3A10和3G12的初步表位鑒定表明,這兩株單抗的表位均跨越了 NSH2和CSH2兩個(gè)重要功能結(jié)構(gòu)域。兩株抗Shp-2單克隆抗體的獲得為研究Shp-2的生物學(xué)功能提供了材料。3、敲除Shp-2的雞肝細(xì)胞系的建立為探究Shp-2與禽類疾病的關(guān)系,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了敲除Shhp-2基因的LMH細(xì)胞系。首先將設(shè)計(jì)的針對Shp-2基因的5條sgRNA克隆至lentiCRISPRv2載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞,嘌呤霉素篩選。通過Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),sgRNA-3的敲除效果最好。通過將轉(zhuǎn)染lentiCRISPRv2-sgRNA-3的LMH細(xì)胞單克隆化,Western blot檢測單克隆細(xì)胞株的Shp-2的蛋白水平,最后獲得穩(wěn)定敲除Shp-2的LMH細(xì)胞系,命名為 LMH-KO-Shp-2-3、LMH-KO-Shp-2-6、LMH-KO-Shp-2-11,為研究 Shp-2 在禽類疾病中的作用提供有力工具。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31
【圖文】：

外一步克隆方法（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ邋ＩＩ邋ｋｉｔ）。將以上回收得到的線性化載體ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ和逡逑ｐｃＤＮＡ３．１、相對應(yīng)的兩種Ｓｈｐ－２目的基因片段在本產(chǎn)品提供的重組酶ＥｘｎａｓｅＴＭ邋ＩＩ作用下逡逑進(jìn)行體外重組反應(yīng)，重組的流程見圖１－１。逡逑下葙弓丨物邐上？５１物逡逑上邋８普邋一－Ａ逡逑（邋ｐＧＥＸ４ｐ４／ｐｃＤ？ｆＡ３．ｉ｜ｉ粒邐＇）邐邐邐逡逑＾邐下？邋引物逡逑｜邋ＰＣＲ邐丨邋ＰＣＲ邋ｆ邋Ｊｔ逡逑命邐Ｊ載體〉邐Q\0４—的—逡逑邐邋邐逡逑＜Ｓ＞Ｐ｜逡逑體外重組邐Ｅｘｎａｓｅ？邋ＩＸ逡逑%煎澹危殄義獻(xiàn)贛希殄危�？Ｔ邋询}荊鍥尾罰у義希恚恚恚恚礤澹叔義稀義賢跡保筆褂茫茫歟錚睿牛穡潁澹螅簀澹桑山屑�；ＧG不蚩寺∈笛榱鞒體義希疲椋紓澹保卞澹校潁錚悖澹洌酰悖邋澹錚駑澹悖歟錚睿椋睿玨澹櫻瑁穡插澹紓澹睿邋澹鰨椋簦楨澹茫歟錚睿牛穡潁澹螅簀澹桑懾義希玻矗倉刈櫸從Ψ椒ㄥ義轄廈媯玻常步夯厥棧竦玫南咝曰靨澹穡牽牛兀叮穡旌停穡悖模危粒常�、蠂D雜Φ牧街旨穡插義夏康幕蚱尾獾煤慫崤ǘ群�，根舅|茫歟錚睿牛穡潁澹螅簀澹桑杉際跛得魘櫓蟹椒ń兄刈�，窂摩体辶x舷等綾恚保�。辶x

本文編號：2784623